郝宏錚 王愛平 王 麗 孫海波

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，主要發(fā)生在尾狀核，殼核背外側(cè)區(qū)，海馬CA1區(qū)和脊髓區(qū)。糖尿病患者卒中發(fā)生率高于正常人群［1-2］?；钚匝酰≧OS）通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf2）在增強(qiáng)炎癥中起重要作用。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)涉及Nrf2，Nrf2在調(diào)節(jié)Ⅱ期基因中起重要作用［3］。在基礎(chǔ)條件下，由于單個(gè)Nrf2蛋白和Keap1之間的相互作用，Nrf2與細(xì)胞質(zhì)中的Keap1結(jié)合［4-5］。暴露于許多應(yīng)激物和誘導(dǎo)劑導(dǎo)致Nrf2從Keap1解離，從而從蛋白酶體降解中拯救Nrf2并允許進(jìn)入細(xì)胞核。因此，Nrf2的激活被認(rèn)為是細(xì)胞保護(hù)劑的重要分子靶標(biāo)［6］。血紅素加氧酶-1（HO-1）是Nrf2的下游調(diào)控因子，也被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的重要調(diào)控酶［7］。丹紅注射液由丹參、紅花、注射用水組成，具有活血化瘀，通脈舒絡(luò)的功能，用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)，對(duì)缺血性腦病、腦血栓均有較好療效；丹紅注射液廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷性顱內(nèi)血腫，肝靜脈閉塞性疾病和心肌再灌注損傷，其通過(guò)抗凝血，抗血栓形成，抗纖維蛋白溶解和抗氧化活性證明了對(duì)腦缺血的保護(hù)作用［8-9］。本研究擬觀察丹紅注射液對(duì)糖尿病合并腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及Nrf2/HO-1通路的影響，為糖尿病合并腦缺血的治療提供理論及臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供體質(zhì)量250～300 g的健康成年Sprague-Dawley大鼠100只［許可證號(hào)：SCXK（遼）2018-0013］。 動(dòng)物飼養(yǎng)室適應(yīng)22～26℃，濕度40%～70%，光暗周期12/12 h。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間自由攝取飼料、自由飲水。

1.2 分組與造模 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成5組：對(duì)照組、模型組、丹紅注射液低（10.0 mg/kg）、中（20.0 mg/kg）、高劑量組（40.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半。通過(guò)單次腹膜內(nèi)（i.p.）注射新鮮溶解于pH4.5的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中的55 mg/kg鏈脲佐菌素（STZ，S0130，Sigma，USA）誘導(dǎo)糖尿病。72 h后測(cè)量血糖水平。

1.3 試藥與儀器 丹紅注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026866，山東丹紅制藥有限公司）、鏈脲佐菌素（STZ，S0130，Sigma，USA）、戊巴比妥鈉（99.9%，Sigma）、Trizol試劑（美國(guó)賽默飛世公司）、一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工）、NRF2、HO-1、β-肌動(dòng)蛋白引物由上海生工科技有限公司合成、NRF2一抗（1∶100，Abcam，UK，ab119339，批次：GR264335-1）、HO-1（馮維勒布蘭德因子）二抗（1∶100，Abcam，UK，ab6994批次：GR223933-3）、NRF2標(biāo)記抗小鼠二抗（1∶100，中國(guó)金杉，中國(guó)，ZF-0312，批次：112242）、HO-1標(biāo)記抗兔二抗（1∶100，中國(guó)杉木，中國(guó)，oZF-0317，批次116128）、DAP（I1 ng/μL；Sigma-Aldrich，Poole，UK，批號(hào)D9542）、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.4 給藥方法 糖尿病組包括血糖水平超過(guò)18 mmol/L的大鼠（模型組及丹紅注射液各劑量組）。注射等體積檸檬酸鹽緩沖液的年齡匹配的非糖尿病大鼠用作非糖尿病對(duì)照［血糖（4.22±1.25）mmol/L］。大鼠在缺血誘導(dǎo)前一晚禁食，但可自由飲水。在模型組及丹紅注射液各劑量組中誘導(dǎo)持續(xù)15 min的前腦缺血。麻醉由3%戊巴比妥鈉注射誘導(dǎo)15 min瞬時(shí)前腦缺血通過(guò)夾住雙側(cè)頸總動(dòng)脈與45～50 mmHg出血性低血壓（通過(guò)放血誘導(dǎo)）相結(jié)合誘導(dǎo)。通過(guò)重新灌注流出的血液并釋放放置在頸動(dòng)脈周圍的結(jié)扎線來(lái)恢復(fù)循環(huán)。丹紅注射液各劑量建模成功后第1天開始給予相應(yīng)藥物灌胃，持續(xù)給予18周，對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水。對(duì)大鼠神經(jīng)缺失癥狀進(jìn)行評(píng)分。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）制作大鼠脊髓HE切片，計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞存活率，即正常細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，以5個(gè)視野的平均值作為最終的神經(jīng)細(xì)胞存活率。2）大鼠脊髓組織中NRF2、HO-1 mRNA水平的測(cè)定。RT-qPCR測(cè)量NRF2、HO-1 mRNA水平。提取各組大鼠腦mRNA。mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以合成的cDNA為模板，NRF2（上游 5′-AGTATGTGGCGGGCTGCTT CG-3′，下游5′-GGAAATAATGAGAGGGAGGA T-3′），HO-1引物（上游5′-AACTTTGCCTGTTACCT TC-3′，下游5′-CAGTCACAATCTGACCTCC-3′），β-肌動(dòng)蛋白引 物（上 游 5′-CGGCAGTCGCCTTGGACGTT-3′，下游 5′-GCCCTTTCCCATCTCAGCAGCC-3′）（Primer Express，Applied Biosystems；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）用于qPCR，β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)參基因。使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行定量。3）NRF2、HO-1蛋白在大鼠海馬組織的表達(dá)水平測(cè)定。取大鼠腦脊髓組織，常規(guī)甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明。將切片在10%正常山羊血清（溶于PBS中）中在室溫下封閉1 h。用PBS洗滌5 min。然后將NRF2抗體（1∶100，Abcam，UK，ab119339，批號(hào) GR264335-1）和 HO-1抗體（1∶100，Abcam，UK，ab6994，批號(hào)GR223933-3）混合并添加至組織中。在4℃過(guò)夜。切片用PBS洗滌3次，每次5 min?？剐∈蠖梗?∶100，中國(guó)金杉，中國(guó)，ZF-0312，批號(hào)112242）和抗兔二抗（1∶100，中國(guó)杉木，中國(guó)，oZF-0317，批號(hào)116128）混合并加入組織中，37℃孵育1 h。用PBS洗滌3次，每次5 min。將切片與室溫下染細(xì)胞核2 min，然后用PBS洗滌5 min。以高放大倍數(shù)（400倍）觀察500個(gè)細(xì)胞。4）ELISA測(cè)定大鼠脊髓組織中蛋白水平。ELISA法測(cè)定MDA、NO、SOD蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，行單因素方差分析，隨后兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分、神經(jīng)細(xì)胞存活率比較 見表1。與對(duì)照組比較，丹紅注射液各劑量組神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分升高（P＜0.05），神經(jīng)細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分降低（P＜0.05），神經(jīng)細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分、神經(jīng)細(xì)胞存活率比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分、神經(jīng)細(xì)胞存活率比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05。下同

組別對(duì)照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分（分）0.00±0.00 14.54±2.95△10.12±1.48*△7.01±1.63*△4.13±0.96*△神經(jīng)細(xì)胞存活率（%）98.63±6.09 52.24±8.98△66.99±5.54*△78.21±6.35*△89.69±8.79*△

2.2 各組大鼠脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的比較 見圖1。對(duì)照組脊髓區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞完整，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)緊密、分布均勻、排列整齊、髓鞘薄厚均勻、結(jié)構(gòu)正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央；模型組脊髓區(qū)可見神經(jīng)纖維排列疏松、多處發(fā)生變性及斷裂、大量壞死神經(jīng)元、細(xì)胞核固縮；丹紅注射液高劑量組脊髓區(qū)見少量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，變性與斷裂顯著減少、髓鞘著色不均勻，局部仍有炎癥反應(yīng)發(fā)生；丹紅注射液中、低劑量組較模型組而言，壞死神經(jīng)元細(xì)胞減少，但經(jīng)元疏松紊亂，細(xì)胞核固縮，脫失現(xiàn)象明顯，具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。

圖1 各組大鼠脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)（400倍）

2.3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組、丹紅注射液低、中劑量組脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較見表3、圖2～圖3。與對(duì)照組比較，模型組、丹紅注射液低、中劑量組脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。免疫組化法下，Nrf2、HO-1陽(yáng)性表達(dá)為棕褐色，Nrf2、HO-1陽(yáng)性表達(dá)情況與各蛋白表達(dá)水平符合。

表2 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20 Nrf2 mRNA 1.13±0.21 2.18±0.19△1.89±0.18*△1.52±0.09*△1.16±0.19*HO-1 mRNA 1.76±0.17 0.98±0.12△1.09±0.17*△1.12±0.16*△1.73±0.20*

表3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠脊髓組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別對(duì)照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20 Nrf2 47.13±15.95 187.66±9.47△165.14±12.74*△132.23±10.73*△65.45±18.76*HO-1 83.67±15.63 271.14±16.78△223.73±13.65*△163.17±99.69*△101.58±13.74*

圖2 各組大鼠脊髓區(qū)NRF2蛋白表達(dá)水平（HE染色，400倍）

圖3 各組大鼠脊髓區(qū)HO-1蛋白表達(dá)水平（HE染色，400倍）

2.5 各組大鼠脊髓組織MDA、NO、SOD蛋白表達(dá)比較 見表4。與對(duì)照組比較，模型組、丹紅注射液低、中劑量組脊髓組織MDA、NO蛋白表達(dá)水平明顯升高，SOD蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組MDA、NO蛋白表達(dá)水平明顯降低，SOD蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠脊髓組織MDA、NO、SOD蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，±s）

表4 各組大鼠脊髓組織MDA、NO、SOD蛋白表達(dá)水平比較（ng/g，±s）

組別對(duì)照組模型組丹紅注射液低劑量組丹紅注射液中劑量組丹紅注射液高劑量組n 20 20 20 20 20 MDA 78.98±16.32 326.21±19.69△201.36±15.32*△136.32±18.32*△81.32±24.36*NO 123.65±23.21 413.65±13.69△302.67±19.32*△203.36±17.32*△129.68±36.69*SOD 599.36±18.63 289.36±18.34△392.39±15.39*△459.25±19.99*△5 893.26±26.39*

3討論

丹紅注射液是一種標(biāo)準(zhǔn)化的水溶性產(chǎn)品，采用現(xiàn)代技術(shù)從中草藥丹參和紅花中提取。丹參、紅花是名貴中草藥，廣泛用于治療心腦血管疾病。丹紅注射液成分復(fù)雜，由原兒茶醛、咖啡酸、丹參素、5-羥甲基-2-糠醛、丹酚酸D、丹酚酸B、丹酚酸A、精酸、阿魏酸和迷迭香酸組成［10-11］。本實(shí)驗(yàn)表明，與模型組比較，丹紅注射液各劑量神經(jīng)缺失癥狀評(píng)分降低，神經(jīng)細(xì)胞存活率升高。這提示丹紅注射液顯著減少了糖尿病合并腦缺血大鼠引起神經(jīng)缺失癥狀，并提升了神經(jīng)細(xì)胞存活率。結(jié)合病理學(xué)結(jié)果，丹紅注射液高劑量組脊髓區(qū)見少量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，變性與斷裂顯著減少、髓鞘著色不均勻，局部仍有炎癥反應(yīng)發(fā)生。這說(shuō)明丹紅注射液能減輕糖尿病合并腦缺血大鼠脊髓神經(jīng)元損傷程度。

抗氧化/親電子反應(yīng)元件（ARE/EpRE）調(diào)節(jié)的Ⅱ期解毒酶和抗氧化劑是抵抗增加的氧化應(yīng)激和維持許多組織中氧化還原狀態(tài)的主要抗氧化途徑之一［12］。HO-1是催化血紅素降解為膽綠素，碳氧化物（CO）和鐵的限速酶，是ARE調(diào)節(jié)的Ⅱ期解毒酶和抗氧化劑之一，受到氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子（Nrf2）的調(diào)節(jié)［13］。HO-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)生在多個(gè)水平上并且是誘導(dǎo)物特異性的。在轉(zhuǎn)錄水平，HO-1由轉(zhuǎn)錄因子Nrf2介導(dǎo)。在生理?xiàng)l件下，Nrf2被Keap1隔離在胞質(zhì)溶膠中，并且靶向蛋白酶體降解。在存在親電子或ROS的情況下，Nrf2從Keap1釋放，然后易位到細(xì)胞核中，激活靶基因（包括HO-1）的轉(zhuǎn)錄。Nrf2對(duì)腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)元和血管變性具有保護(hù)作用［14］。據(jù)報(bào)道，HO-1在其啟動(dòng)子上具有最多的ARE，使其成為預(yù)防腦缺血神經(jīng)損傷的高效治療靶標(biāo)。HO-1的過(guò)表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠的永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型（MCAO）中具有神經(jīng)保護(hù)作用［15］。此外，HO-1的藥理學(xué)誘導(dǎo)已被證明可以保護(hù)視網(wǎng)膜免受急性青光眼誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，丹紅注射液各劑量組Nrf2、HO-1 mRNA、蛋白表達(dá)水平、MDA、NO蛋白表達(dá)水平明顯降低，SOD蛋白表達(dá)水平明顯升高。這提示丹紅注射液抑制Nrf2、HO-1 mRNA、蛋白的表達(dá)水平激活抗氧化途徑，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平，進(jìn)而對(duì)糖尿病合并腦缺血大鼠的神經(jīng)起保護(hù)作用。

綜上所述，丹紅注射液顯著減少糖尿病合并腦缺血大鼠引起的神經(jīng)缺失癥狀，減輕脊髓神經(jīng)元損傷程度；其機(jī)制與抑制Nrf2、HO-1 mRNA、蛋白的表達(dá)水平激活抗氧化途徑，降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平有關(guān)。