肖叔敏 葉翠 周賽君 于珮

天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院腎病透析科，國家衛(wèi)生健康委員會激素與發(fā)育重點實驗室(天津醫(yī)科大學)，天津市代謝性疾病重點實驗室，天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內分泌研究所 300070

2型糖尿病(T2DM)發(fā)病機制錯綜復雜，尚不明確，且慢性并發(fā)癥較多，嚴重影響患者的生活質量；其中，心血管并發(fā)癥是糖尿病常見的大血管并發(fā)癥之一，也是最常見的糖尿病患者死亡的原因[1-2]。以往研究表明，T2DM與免疫炎性反應關系密切，且“免疫-代謝”學說也已成為研究T2DM及其慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的新熱點[3]。自然殺傷細胞(NK細胞)參與機體固有免疫，其活化形式NKT細胞可以分泌多種細胞因子，參與免疫過程[4-5]。以往研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞與T2DM有關，但其在T2DM患者外周血中的變化及其與T2DM心血管并發(fā)癥有何聯(lián)系尚不明確[6-7]。為進一步探討T2DM及其心血管并發(fā)癥與免疫炎性反應的關系，本研究選取T2DM患者和正常對照人群，對其NK細胞及相關指標進行檢測分析，為臨床監(jiān)測T2DM及其心血管并發(fā)癥提供新方法。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取于2015年6月—2016年2月于天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院住院治療的T2DM患者124例作為T2DM組，其中男性74例，女性50例，平均年齡(55.4±11.8)歲。T2DM診斷標準參考1999年WHO糖尿病診斷標準。T2DM伴冠心病的診斷標準為：(1)既往有心肌梗死病史或典型心絞痛病史，?？漆t(yī)院或綜合醫(yī)院的心內科確診為冠心病。(2)冠狀動脈造影發(fā)現(xiàn)至少一支冠狀動脈主要分支狹窄程度≥50%。(3)核素心肌顯像檢查結果提示有心肌缺血，滿足以上任何一條即可診斷冠心病。選取年齡、性別均匹配的天津醫(yī)科大學總醫(yī)院空港醫(yī)院的50名健康體檢志愿者作為對照組，其中男性28名，女性22名，平均年齡(52.5±8.3)歲。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署了知情同意書，均排除心、肝、腦等重要臟器重大疾病，近1個月內無任何形式的感染、外傷、手術等應激情況。

1.2 研究方法

1.2.1 基本臨床指標檢測 所有研究對象均完善個人詳細信息，禁食12 h后，于次日清晨7:30～8:30空腹采取肘正中靜脈血標本，采用德國Byer公司的全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白-膽固醇(VLDL-C)、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、γ谷氨酰轉移酶、總膽紅素、直接膽紅素、血尿酸、血肌酐、尿素氮，采用乳膠增強免疫比濁法檢測C反應蛋白，葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖及餐后2 h血糖(2 hPG)，高壓液相法測HbA1c。穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。估算的腎小球濾過率(eGFR)釆用CKD-EPI公式計算。

1.2.2 外周血單個核細胞的分離 所有受試者留取空腹靜脈血3 ml左右，用密度梯度離心法(Ficoll)分離外周血單個核細胞，具體步驟如下：

(1)在EDTA抗凝管中加入3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻。(2)取3 ml單個核細胞分離液加入到離心管中，25℃，離心半徑3 cm，4 000 r/min，離心5 min，加入靜脈血；25℃，離心半徑3 cm，2 000 r/min，再次離心25 min。離心后可見4層，從上往下分別為血漿層、外周血單個核細胞層(白膜層)、單個核細胞分離液層、紅細胞和粒細胞層。(3)吸取白膜層于新的離心管中，加入5 ml PBS，混勻，4℃，離心半徑3 cm，1 400 r/min，離心10 min。(4)棄上清，加入5 ml PBS，混勻，4℃，離心半徑3 cm，1 400 r/min，離心10 min。(5)重復上述步驟1～2次，棄上清，適當PBS重懸細胞，加入到細胞計數(shù)板上，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.3 NK細胞的檢測 取分離后的外周血單個核細胞，采用美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀檢測NK細胞數(shù)量和NKT細胞數(shù)量。

2 結果

2.1 T2DM組與對照組臨床資料比較 與對照組相比，T2DM組直接膽紅素、總膽固醇、甘油三酯、HbA1c、空腹血糖水平升高，HDL-C水平下降(P均<0.01)；兩組間谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、γ谷氨酰轉移酶、總膽紅素、LDL-C、尿素氮、血肌酐、血尿酸、C反應蛋白差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表1。

2.2 T2DM組與對照組NK細胞、NKT細胞數(shù)量的比較及影響因素分析 NK細胞為CD3-CD56+細胞，NKT細胞為CD3+CD56+細胞(圖1)。與對照組相比，T2DM組NK細胞和NKT細胞數(shù)量明顯下降(P均<0.01)，見表2。雙變量相關分析結果顯示，T2DM組NK細胞水平與年齡、病程呈負相關；NKT細胞水平與年齡、HOMA-IR、甘油三酯、VLDL-C呈負相關，與HDL-C、eGFR呈正相關，見表3和表4。以NK細胞水平為因變量，年齡和病程為自變量進行多元回歸分析，結果顯示，病程與NK細胞水平呈負相關(表5)。以NKT細胞水平為因變量，以年齡、HOMA-IR、甘油三酯、VLDL-C、HDL-C、eGFR為自變量進行多元回歸分析，結果顯示HOMA-IR和eGFR與NKT細胞呈正相關，見表6。

表1 T2DM組與對照組臨床資料比較

注：T2DM：2型糖尿?。籋DL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇

2.3 T2DM不同病程組NK細胞、NKT細胞數(shù)量的比較 與對照組相比，T2DM病程≤8年組(短病程組)、T2DM病程>8年組(長病程組)NK細胞和NKT細胞數(shù)量明顯下降(P均<0.01)；并且與短病程組相比，長病程組NK細胞數(shù)量明顯下降(P<0.01)，NKT細胞下降無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表7。

表2 T2DM組與對照組NK細胞、NKT細胞比較

組別例數(shù)NK細胞(%)NKT細胞(%)對照組5016.37±6.604.27(2.15,7.38)T2DM組12411.54±5.471.95(1.55,2.45)t/U值4.63729.50P值<0.01<0.01

注：NK細胞：自然殺傷細胞；NKT細胞：自然殺傷T細胞；T2DM組：2型糖尿病組

表3 T2DM患者NK細胞與臨床資料相關性分析

注：NK細胞：自然殺傷細胞；T2DM：2型糖尿病；BMI：體重指數(shù)；2 hPG：餐后2 h血糖

表4 T2DM患者NKT細胞與臨床資料相關性分析

注：NKT細胞：自然殺傷T細胞；T2DM：2型糖尿??；BMI：體重指數(shù)；2 hPG：餐后2 h血糖；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)；VLDL-C：極低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；eGFR：估算的腎小球濾過率

表5 T2DM患者NK細胞相關因素的多元線性回歸分析

注：NK細胞：自然殺傷細胞；T2DM：2型糖尿病

表6 T2DM患者NKT細胞相關因素的多元線性回歸分析

注：NKT細胞：自然殺傷T細胞；T2DM：2型糖尿??；eGFR：估算的腎小球濾過率；HOMA-IR：穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)

表7 T2DM不同病程組NK細胞及NKT細胞比較

注：與NC組相比，aP<0.01；與T2DM≤8年組相比，bP<0.01；NK細胞：自然殺傷細胞；NKT細胞：自然殺傷T細胞；短病程組：2型糖尿病病程≤8年組；長病程組：2型糖尿病病程>8年組

2.4 NK細胞、NKT細胞在T2DM伴冠心病患者中數(shù)量的變化及其監(jiān)測價值 將T2DM按照有無并發(fā)冠心病分為T2DM不伴冠心病組和T2DM伴冠心病組。與對照組相比，T2DM不伴冠心病組NK細胞和NKT細胞數(shù)量下降(P均<0.05)；T2DM伴冠心病組NK細胞和NKT細胞數(shù)量均明顯下降(P均<0.01)。與T2DM不伴冠心病組相比，T2DM伴冠心病組NK細胞數(shù)量顯著下降(P<0.01)，NKT細胞數(shù)量明顯下降(P<0.05)，見表8。

組別例數(shù)NK細胞(%)NKT細胞(%)對照組5016.37±6.604.27(2.15,7.38)T2DM不伴CHD組1312.94±3.55a2.06(1.61,2.60)aT2DM伴CHD組417.56±2.30bc1.81(1.59,2.13)bdF/H值33.9015.22P值<0.01<0.01

注：與NC組相比，aP<0.05，bP<0.01；與T2DM組相比，cP<0.01，dP<0.05；NK細胞：自然殺傷細胞；NKT細胞：自然殺傷T細胞；T2DM不伴CHD組：2型糖尿病不伴冠心病組；T2DM伴CHD組：2型糖尿病伴冠心病組

通過對T2DM不伴冠心病組與T2DM伴冠心病組的一般情況及臨床指標分析顯示，與T2DM不伴冠心病組相比，T2DM伴冠心病組年齡大，病程長(P均<0.01)；HbA1c水平升高，eGFR降低(P均<0.05)，見表9。進一步對兩組間有明顯統(tǒng)計學意義的NK細胞繪制ROC曲線，其曲線下面積為0.92，95%CI為0.84～0.99，取截點為9.1%，其敏感性為90.9%，特異性為80.5%，見圖2。

3 討論

T2DM與免疫炎性反應有著密切的聯(lián)系。近年來，眾多研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者存在明顯的免疫系統(tǒng)的異常[8-9]。機體免疫系統(tǒng)包括固有免疫和適應性免疫，其中固有免疫是機體免疫的第一道防線，而NK細胞是固有免疫的重要成員[5]。NK細胞不僅可以通過多種機制參與機體的免疫防御，而且可以介導和參與系統(tǒng)性炎性反應[10]。既往對于NK細胞在T2DM患者外周血中變化的研究結果不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者NK細胞數(shù)目與正常人相比無明顯差異，但是活化狀態(tài)的NK細胞數(shù)量較正常人有所升高，研究者認為，NK細胞主要通過分泌細胞因子參與T2DM的發(fā)病過程，活化狀態(tài)的NK細胞才具有分泌細胞因子的功能，所以在T2DM狀態(tài)下，未活化的NK細胞會轉化為活化狀態(tài)的NK細胞，而總的NK細胞數(shù)目不發(fā)生變化[11]。也有研究觀察到與正常人相比，T2DM患者NK細胞數(shù)量上升[12]。上述研究的差異性可能與入選人群有關。筆者的結果發(fā)現(xiàn)，T2DM患者外周血中NK細胞和NKT細胞的數(shù)量相對于對照組明顯降低，統(tǒng)計分析顯示這種變化與病程密切相關，在不同病程的T2DM患者外周血中NK細胞的數(shù)量存在差異，與短病程組相比，長病程組NK細胞和NKT細胞的數(shù)量更少。有文獻曾報道，外周血中NK細胞的數(shù)目和活性受氧化應激和多種炎性因子的影響[13-14]。T2DM患者處于慢性炎性反應狀態(tài)，炎性反應過程中釋放的炎性因子，以及機體高糖導致氧化應激反應過程中產生的活性氧簇等產物可能會損傷NK細胞，并影響NK細胞的激活。所以，T2DM患者外周血中NK細胞以及NKT細胞的這種變化可能是T2DM慢性炎性反應的結果。

以往的研究在對頸動脈切片進行免疫組化染色后，發(fā)現(xiàn)在各個階段的斑塊中均有NK細胞存在，并發(fā)現(xiàn)NK細胞與內皮細胞和巨噬細胞有緊密接觸[15]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血中NK細胞數(shù)量減少[16-17]。上述研究提示，NK細胞與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展有重要聯(lián)系。筆者的研究結果顯示，T2DM伴冠心病組較T2DM不伴冠心病組NK細胞和NKT細胞數(shù)量下降。這與以往的研究結果一致。T2DM伴冠心病患者外周血中NK細胞數(shù)量下降的原因可能與其凋亡數(shù)目增加有關，誘導其凋亡的因素可能包括氧化應激、細胞因子等。筆者通過ROC曲線分析顯示，應用NK細胞的數(shù)量監(jiān)測T2DM伴冠心病并發(fā)癥有較好的敏感性和特異性，可作為其診斷與監(jiān)測的指標之一。

表9 T2DM伴CHD組與T2DM不伴CHD組臨床指標的比較

注：NK細胞：自然殺傷細胞；NKT細胞：自然殺傷T細胞；eGFR：估算的腎小球濾過率；T2DM不伴CHD組：2型糖尿病不伴冠心病組；T2DM伴CHD組：2型糖尿病伴冠心病組

本研究從NK細胞出發(fā)揭示了T2DM患者體內炎性反應狀態(tài)與免疫系統(tǒng)功能的關系?；诒狙芯亢鸵酝难芯拷Y果，提示T2DM患者外周血中NK細胞和NKT細胞的減少可能是與T2DM患者體內的炎性狀態(tài)有關。 綜上所述，T2DM的發(fā)生、發(fā)展與免疫炎性反應有著密切的聯(lián)系，筆者的研究結果為T2DM與免疫炎性反應的關系提供了新的證據(jù)。