賈晨晨，包煥玲，孟現(xiàn)堯，朱曉振，衣悅濤

（1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東煙臺(tái)264003；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.山東東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺(tái)264003）

近年來(lái)，我國(guó)刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。2017年我國(guó)刺參總產(chǎn)量達(dá)25萬(wàn)噸，是海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱型產(chǎn)業(yè)（姜森顥等，2017）。但由于刺參缺乏特異性免疫，細(xì)菌性疾病對(duì)刺參危害極大。燦爛弧菌作為一種致病性嗜鹽細(xì)菌（馬愛(ài)敏等，2009），是引發(fā)刺參腐皮綜合征的主要致病菌。刺參感染燦爛弧菌后會(huì)造成極高的死亡率，制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（王印庚等，2004）。

為提高刺參抗病力，除了微生態(tài)制劑、中草藥成分添加劑改善刺參免疫能力外，利用益生元改善刺參腸道健康也是一種前景良好的新策略（趙倩等，2017；柳序等，2016）。研究證明，益生元能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用率，增強(qiáng)新陳代謝，并促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)其抗病能力（Guer reiro等，2017；Yang等，2016；Torrecillas等，2011），這些研究為益生元在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。

菊芋全粉微溶于水，制備成本低，其中含50%～60%的菊粉，菊粉作為水溶性益生元，具有調(diào)節(jié)腸道微生物組成、增強(qiáng)免疫和提高抗病能力等功能。因菊粉使用成本高，水溶性強(qiáng)，因此本試驗(yàn)選用菊芋全粉作為益生元飼料添加劑應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖中，研究其對(duì)刺參生長(zhǎng)性能、燦爛弧菌刺激下刺參體腔液中相關(guān)免疫酶應(yīng)答變化的影響，以期為菊芋全粉在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用及刺參的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)所用刺參由山東東方海洋科技股份有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)提供，初始體重為（4.7±0.1）g，將刺參飼養(yǎng)于40 L塑料質(zhì)水箱中，水溫（17±1）℃，pH（8.1±0.2），海水鹽度為27‰～29‰，每日投喂1次（16：00）飼料，投喂量為刺參體重的3%，每日采用虹吸法去除殘餌及糞便并換水30%。暫養(yǎng)1周后用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 暫養(yǎng)結(jié)束后，挑選360只健康刺參，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)平行，每個(gè)平行20只刺參，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組分別在基礎(chǔ)飼料中添加5 g/kg和15 g/kg菊芋全粉，飼養(yǎng)周期為28 d。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 燦爛弧菌感染試驗(yàn) 28 d養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行感染試驗(yàn)，試驗(yàn)使用的燦爛弧菌經(jīng)活化后接種于2216E培養(yǎng)液中（梁超，2011），在30℃下培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度為109cell/mL，用1 mL無(wú)菌注射器經(jīng)腹腔注射對(duì)刺參進(jìn)行感染，每只注射量為0.1 mL。繼續(xù)投喂飼料。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能指數(shù)測(cè)定及分析 試驗(yàn)前將各組刺參稱重并計(jì)算平均初重W0，分別在飼養(yǎng)試驗(yàn)第28天時(shí)，將各組刺參禁食24 h后，稱重Wt，日增重（ADG）和飼料利用率（FCR）計(jì)算公式如下：

式中：t為飼養(yǎng)試驗(yàn)天數(shù)，d；F為刺參總攝食量，g。

1.4.2 免疫因子活力變化的測(cè)定 在感染試驗(yàn)后第0、1、2、3、4、5天時(shí)分別從每組取出9只健康刺參，在冰盤上取出刺參體腔液，于4℃、3000 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，置于-80℃冰箱中保存，用作體腔液免疫指標(biāo)的測(cè)定。

刺參體腔液樣品中酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）和超氧化物歧化酶（SOD）活性采用試劑盒（南京建成公司）測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋全粉對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響 由表2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ組刺參的平均日增重和平均日攝食量差異不顯著（P＞0.05）；試驗(yàn)Ⅱ組刺參的飼料利用率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明15 g/kg菊芋全粉能顯著提高刺參的飼料利用率。

2.2 菊芋全粉對(duì)燦爛弧菌刺激后刺參免疫因子應(yīng)答變化的影響

2.2.1 燦爛弧菌刺激后刺參ACP活力變化 測(cè)定結(jié)果顯示，燦爛弧菌刺激后，刺參的ACP活性呈先增加后降低的周期性變化，試驗(yàn)Ⅰ組刺參ACP活力在第3天顯著高于對(duì)照組，而在第2、第4天卻顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅱ組刺參的ACP活力在第3天時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其他時(shí)間與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖1）。

表2 菊芋全粉對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響

圖1 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中ACP活力變化

2.2.2 燦爛弧菌刺激后刺參AKP活力變化 由圖2可知，燦爛弧菌刺激后刺參AKP活力急劇增加，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)AKP系統(tǒng)的應(yīng)答能力逐漸恢復(fù)到初始水平。這可能是由于AKP完成了對(duì)入侵燦爛弧菌的免疫應(yīng)答。此外，試驗(yàn)Ⅱ組刺參AKP活力始終顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），結(jié)果表明在燦爛弧菌感染時(shí)，添加15 g/kg菊芋全粉可以顯著提高刺參AKP活力。

2.2.3 燦爛弧菌刺激后刺參SOD活力變化 由圖3可知，相較于對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅰ組刺參在細(xì)菌感染1 d后SOD活力顯著提高（P＜0.05），之后下降并逐漸趨于初始水平；試驗(yàn)Ⅱ組刺參在細(xì)菌感染第1天和第2天時(shí)SOD活力始終顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），并從第3天開(kāi)始逐漸下降至初始水平。結(jié)果表明在燦爛弧菌刺激下，15 g/kg菊芋全粉對(duì)SOD活力的提高作用更為明顯。

2.2.4 燦爛弧菌刺激后刺參LYZ活力變化 如圖4所示，燦爛弧菌刺激后第1、2天，試驗(yàn)Ⅱ組與對(duì)照組刺參LYZ活力受到抑制，而試驗(yàn)Ⅰ組刺參LYZ活力顯著升高（P＜0.05），并在第4天時(shí)恢復(fù)到初始水平。結(jié)果表明燦爛弧菌會(huì)抑制刺參的溶菌應(yīng)答反應(yīng)，飼料中添加5 g/kg菊芋全粉可顯著改善這種抑制。

3 討論

3.1 菊芋全粉對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響 關(guān)于益生元對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響報(bào)道不一，有研究認(rèn)為并無(wú)顯著效果，也有研究證明益生元可改善水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能（Guerreiro等，2015；孫永欣等，2012；Ringo等，2010），這可能與益生元的種類、添加量及水產(chǎn)動(dòng)物的種類、年齡、養(yǎng)殖方式等均有關(guān)系。本研究采用菊芋全粉作為益生元飼料添加劑，試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加15 g/kg菊芋全粉可顯著提高刺參的飼料利用率，其原因可能是菊芋全粉會(huì)影響刺參腸道結(jié)構(gòu)或者消化酶活性，進(jìn)而促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)，提高其對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，這與Abdelmalek等（2015）對(duì)海鱸魚(yú)的研究結(jié)果一致。本研究中菊芋全粉對(duì)刺參的ADG影響不大，可能是試驗(yàn)周期短，其中機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

3.2 菊芋全粉對(duì)燦爛弧菌刺激后刺參免疫因子應(yīng)答變化的影響 燦爛弧菌作為刺參腐皮病的主要病原菌，制約著刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。益生元作為功能性成分，可以改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。因此本研究將菊芋全粉作為益生元飼料添加劑應(yīng)用于刺參飼料中，研究其對(duì)燦爛弧菌刺激后刺參體腔液內(nèi)免疫因子如ACP、AKP、SOD及LYZ活力變化的影響。其中ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，可吞噬消化顆粒形異物（Meng等，2003）。本研究結(jié)果顯示燦爛弧菌感染時(shí)，ACP可有效應(yīng)答弧菌入侵，其活力呈現(xiàn)先增加后降低的周期性變化，這可能是由于ACP大量參與對(duì)弧菌的反應(yīng)，使得ACP活力提高，隨后由于ACP大量消耗造成ACP活力暫時(shí)性下降，研究結(jié)果表明，15 g/kg菊芋全粉可抑制ACP活力降低的程度。AKP是一種對(duì)底物專一性要求較低的磷酸單脂水解酶，是重要的解毒系統(tǒng)，并與一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)（Zhang等，2000）。研究結(jié)果表明，15 g/kg菊芋全粉可顯著提高細(xì)菌感染時(shí)刺參AKP活力，劉云等（2008）用海藻硫酸多糖與殼聚糖喂養(yǎng)刺參，也得到了類似結(jié)果。SOD作為一種重要的抗氧化酶，主要參與清除體內(nèi)過(guò)量的自由基，同時(shí)在機(jī)體清除病原菌過(guò)程中增強(qiáng)自我防御功能，因此SOD活力是反映機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)（董曉亮等，2013），本研究結(jié)果表明燦爛弧菌刺激后，刺參SOD活力呈現(xiàn)先升高后逐漸恢復(fù)至初始水平的趨勢(shì)，其中菊芋全粉添加量為15 g/kg時(shí)效果最佳，該結(jié)果與貽貝（Mytilus edulis）（Tanguy等，2013）的結(jié)果不同，燦爛弧菌并沒(méi)有抑制SOD系統(tǒng)的應(yīng)答能力，這可能與動(dòng)物種類、年齡有關(guān)。LYZ通過(guò)水解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的乙酰氨基多糖，可破壞和消除入侵異物，從而起到殺菌防御功能（王淑嫻等，2010）。研究結(jié)果表明，燦爛弧菌入侵初期，對(duì)照組刺參LYZ活力受到抑制，這與叢聰（2015）的研究結(jié)果一致，但5 g/kg菊芋全粉組刺參LYZ活力卻顯著增強(qiáng)，這表明5 g/kg菊芋全粉在燦爛弧菌感染初期可顯著提高LYZ活力。

圖2 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中AKP活力變化

圖3 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中SOD活力變化

圖4 燦爛弧菌刺激后刺參體腔液中LYZ活力變化

4 結(jié)論

日糧中添加15 g/kg菊芋全粉可顯著提高刺參的飼料利用率；燦爛弧菌刺激時(shí)能有效地提高刺參體液中ACP、AKP、SOD活力，而5 g/kg菊芋全粉可顯著提高燦爛弧菌誘導(dǎo)時(shí)刺參LYZ活力；綜上，本試驗(yàn)條件下菊芋全粉的添加量為15 g/kg時(shí)，刺參的免疫因子活力提高效果顯著，因此菊芋全粉具備作為刺參免疫增強(qiáng)劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。