王紅波，陳國(guó)鑫，魏 蜜，劉智杰，陳禪友

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430056；2.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北孝感432000）

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、改善腦機(jī)能、增強(qiáng)記憶、抗焦慮等生理功能（Kantachote等，2016）。GABA作為飼料添加劑，能夠提高動(dòng)物抗應(yīng)激能力，改善胴體品質(zhì)和提高生產(chǎn)性能（汪祥燕等，2016)。潘雪梅等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，GABA可以緩解奶牛夏季的熱應(yīng)激，提高奶牛免疫能力和機(jī)體的抗氧化能力。Park等（2015）研究結(jié)果表明，GABA作為飼料添加劑能顯著提高蛋雞的生產(chǎn)能力，改善雞蛋品質(zhì)。常見的生產(chǎn)GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌（Kang等，2017）。管軍軍等（2018）認(rèn)為，乳酸菌是定植在動(dòng)物腸道中的益生菌，有利于動(dòng)物的腸道健康，常被用于制備發(fā)酵飼料，有助于動(dòng)物的健康養(yǎng)殖。徐秀景等（2018）研究表明，乳酸菌發(fā)酵制備的固態(tài)發(fā)酵飼料，能夠改善豬肉的品質(zhì)，提高育肥豬的生長(zhǎng)性能。乳酸菌與GABA的聯(lián)合生產(chǎn)，能夠顯著改善飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。沈雪嬌等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)GABA的短乳桿菌P-14發(fā)酵飼料應(yīng)用于育肥豬的飼養(yǎng)，能提高其生產(chǎn)性能，改善豬肉的品質(zhì)，提高飼料的報(bào)酬率。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842是一種在食品加工領(lǐng)域重要的益生菌，在乳制品和功能飲料加工過(guò)程中已展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景（毛雪等，2016）。在飼料加工領(lǐng)域，保加利亞乳桿菌ATCC 11842也具有良好的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)探索保加利亞乳桿菌ATCC 11842生物合成GABA的規(guī)律，為生產(chǎn)富含GABA的發(fā)酵飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 GABA標(biāo)準(zhǔn)品、MRS培養(yǎng)基和谷氨酸鈉均購(gòu)于北京酷來(lái)搏科技有限公司；苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸鈉、氫氧化鈉和無(wú)水乙醇均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；保加利亞乳桿菌ATCC 11842保藏于江漢大學(xué)湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心食品加工實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備 V-1600紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；TG165型離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；HH-2型水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)與GABA生物合成方法 菌體培養(yǎng)方法：保加利亞乳桿菌ATCC 11842活化培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃；保加利亞乳桿菌ATCC 11842生長(zhǎng)培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，接種量為2%；生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基置于50 mL離心管，裝液量為48 mL，調(diào)整液體培養(yǎng)基pH，控制培養(yǎng)溫度，厭氧靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)36 h；每個(gè)樣品重復(fù)3次。

GABA生物合成方法：在菌體生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基中添加0.25 g谷氨酸鈉底物，調(diào)整液體培養(yǎng)基pH，控制培養(yǎng)溫度，生物轉(zhuǎn)化48 h；每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.2 菌體生物量測(cè)定方法 定時(shí)取0.5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，6000 r/min離心15 min，棄上清液，用0.5 mL無(wú)菌水懸浮菌體，在600 nm條件下測(cè)定菌體光密度值（吳軍林等，2018）。在600 nm波長(zhǎng)條件下，繪制菌體生物量與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出培養(yǎng)基中濕菌體的濃度。

1.3.3 GABA樣品制備及其檢測(cè)方法 GABA樣品制備：取1 mL發(fā)酵液體培養(yǎng)基于1.5 mL離心管，6000 r/min離心10 min，得到的上清液用于GABA含量的檢測(cè)。

檢測(cè)方法：取0.3 mL上清液于25 mL離心管中；依次加入0.2 mL的0.2 M硼酸鹽緩沖液（pH 9.0），1 mL的6%苯酚溶液，0.8 mL的5%次氯酸鈉溶液，充分振蕩混勻；置于沸水浴中保持10 min；然后迅速置于冰浴中保持15 min；劇烈振蕩至顯示藍(lán)色；最后加入2 mL的60%乙醇溶液；在645 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)光密度值（Zhang等，2014）。

2 結(jié)果與分析

乳酸菌生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生物合成GABA分為兩個(gè)階段。第一階段為乳酸菌的生長(zhǎng)階段，在此階段需要提供乳酸菌良好生長(zhǎng)環(huán)境，使乳酸菌達(dá)到最大的生物量；第二階段是GABA的生物合成階段，在此階段需要控制谷氨酸脫羧酶良好的活性環(huán)境，谷氨酸鈉在谷氨酸脫羧酶的催化作用下生物合成GABA（Ttt等，2014）。Shi等（2017）研究表明用短乳桿菌靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA有兩個(gè)關(guān)鍵的控制因素，一是pH控制在4.5，二是溫度控制在45℃。Peng等（2013）研究結(jié)果也表明分步控制溫度和pH條件，用短乳桿菌CGMCC 1306生物轉(zhuǎn)化谷氨酸能獲得良好的轉(zhuǎn)化效率。因此，本研究探索分兩階段分別控制菌株的生長(zhǎng)和GABA的生物合成，以期提高GABA的產(chǎn)量。

2.1 pH和溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 由圖1可知，pH能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長(zhǎng)。在菌株生長(zhǎng)36 h時(shí)，pH為5、6、7、8、9時(shí)的菌體生物量分別為11.60、17.10、15.58、13.93、9.48 g/L。pH高于9時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到顯著抑制。pH為6時(shí)菌株的生長(zhǎng)最佳。終產(chǎn)物乳酸的積累是抑制乳酸菌生長(zhǎng)的重要原因，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH會(huì)影響乳酸菌生長(zhǎng)。閆征等（2003）研究表明，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，乳酸菌在pH 6和pH 6.5條件下，表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)。楊靜等（2017）的研究結(jié)果也表明，乳酸菌生長(zhǎng)的最適pH為5.5～7.0。

由圖2可知，溫度能顯著影響保加利亞乳桿菌ATCC 11842的生長(zhǎng)。在菌株生長(zhǎng)36 h時(shí)，溫度為25、30、35、40、45℃時(shí)的菌體生物量分別為13.60、15.44、16.90、15.62、5.40 g/L。溫度高于45℃，菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制。其中35℃是菌株生長(zhǎng)的最佳溫度。王奎明（2007）研究結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中和37℃條件下生長(zhǎng)良好。培養(yǎng)基組分也會(huì)影響保加利亞乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度。曾少葵等（2017）以牡蠣酶解液為原料，保加利亞乳桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為40℃。

圖1 不同pH條件下菌體生長(zhǎng)曲線

2.2 pH和溫度對(duì)GABA生物合成的影響 pH和溫度會(huì)影響酶分子的活性結(jié)構(gòu)以及酶分子與底物的結(jié)合（周文斯等，2018；陳穩(wěn)等，2018）。調(diào)控反應(yīng)的溫度和pH對(duì)谷氨酸脫羧酶活性有重要影響，進(jìn)而影響GABA的生物合成（Wu等，2018；時(shí)粲等，2016）。

保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)36 h時(shí)，培養(yǎng)基pH降為6.0，當(dāng)添加0.25 g谷氨酸鈉后，培養(yǎng)基pH變?yōu)?.5。在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵液的pH分別至5、6、7、8、9，溫度為35℃，生物轉(zhuǎn)化48 h后，比較GABA的產(chǎn)量。由圖3可知，pH能顯著影響GABA的產(chǎn)量。在pH為5、6、7、8、9五個(gè)不同條件下GABA產(chǎn)量分別為3.25、3.30、3.75、5.0、3.71 g/L。其中pH為8時(shí)GABA生物合成量最高。隨著菌株的生長(zhǎng)，菌株產(chǎn)酸也會(huì)使發(fā)酵液的pH降低。孟丹等（2017）研究表明，乳酸乳球菌乳亞種HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH為6.5，其發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的質(zhì)量濃度為0.22 g/L。曾林等（2017）從四川泡菜中分離出一株具有產(chǎn)GABA能力的植物乳桿菌BC114，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，其最佳pH為5.50，GABA產(chǎn)量為3.82 g/L。

圖2 不同溫度條件下菌體生長(zhǎng)曲線

圖3 不同p H條件下GABA產(chǎn)量

由圖4可知，溫度能顯著影響GABA的產(chǎn)量。在溫度為25、30、35、40、45℃條件下的GABA產(chǎn)量分別為2.57、2.69、3.33、4.77、3.96 g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳溫度。韓昱姝等（2017）從泡菜中篩選出一株短乳桿菌LF-fb-017，其GABA產(chǎn)量可達(dá)1.68 g/L，其最佳生物轉(zhuǎn)化溫度為37℃。Park等（2014）研究結(jié)果也表明，乳酸菌來(lái)源的谷氨酸脫羧酶最佳活性溫度為41℃。

2.3 優(yōu)化前后GABA產(chǎn)量的比較 參照前期研究方法，保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉合成GABA，在自然pH和恒溫30℃條件下，GABA產(chǎn)量為2.36 g/L（Wang等，2019）。用兩階段調(diào)控生物合成GABA的方法，菌株在初始pH 6.0，溫度35℃條件下生長(zhǎng)36 h，再調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0，溫度調(diào)整至40℃，生物轉(zhuǎn)化48 h，GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98 g/L，如圖5。優(yōu)化后GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前GABA的產(chǎn)量提高了153.39%。張?bào)糜⒌龋?014）從豆豉中篩選的產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15，該菌株在含1%（W/W）谷氨酸鈉的MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量達(dá)到0.161 g/L。史曉萌等（2017）從哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出一株乳酸乳球菌KCH1，GABA產(chǎn)量達(dá)329.81 mg/L。吳非等（2012）利用紫外線對(duì)GABA高產(chǎn)菌株保加利亞乳桿菌L2進(jìn)行誘變處理，獲得高產(chǎn)GABA突變菌株L2-4，其在含有1%L-谷氨酸改良MRS培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量達(dá)到4.235 g/L。因此，保加利亞乳桿菌ATCC 11842 GABA的合成能力顯著高于上述報(bào)道的乳酸菌株。

圖4 不同溫度條件下GABA產(chǎn)量

圖5 優(yōu)化前后GABA產(chǎn)量對(duì)比

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)菌株生長(zhǎng)和GABA生物合成的pH和溫度進(jìn)行兩階段分開控制，能顯著提高GABA的產(chǎn)量。菌株在初始pH 6.0，溫度35℃條件下生長(zhǎng)36 h后，再調(diào)整發(fā)酵液pH至8.0，溫度40℃，GABA的產(chǎn)量達(dá)到5.98 g/L。優(yōu)化后GABA的產(chǎn)量較優(yōu)化前GABA的產(chǎn)量提高153.39%。