鄧 文，徐 彬，孫全友，付 趁，鄭新社，陳國(guó)參，李紹鈺，王琳燚*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南科學(xué)院 生物研究所有限責(zé)任公司，河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450008）

斷奶會(huì)給仔豬造成嚴(yán)重應(yīng)激，研究表明仔豬斷奶后腸道會(huì)發(fā)生顯著變化，如腸道絨毛萎縮，隱窩加深，腸道微生物區(qū)系紊亂等（Zhu等，2012）。另外，斷奶應(yīng)激還會(huì)導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞損傷，上皮通透性增加（華朱鳴，2012）。腸道絨毛的萎縮及上皮損傷不僅會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且降低了對(duì)有害物質(zhì)的屏障作用，腸道有害物質(zhì)如內(nèi)毒素更易于入侵腸道黏膜下層，誘發(fā)腸道局部甚至機(jī)體的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步降低斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能。微生物區(qū)系紊亂導(dǎo)致有害菌的大量繁殖更會(huì)加劇這一惡性循環(huán)。因此，改善斷奶仔豬腸道健康對(duì)緩解斷奶仔豬應(yīng)激，提高其生長(zhǎng)性能有重要意義。

益生菌是指活的微生物制劑，芽孢桿菌由于其對(duì)環(huán)境的高耐受性而備受青睞。低聚木糖是指2～7個(gè)木糖分子以β-1，4糖苷鍵連接而成的寡糖，其作為益生元可促進(jìn)腸道雙歧桿菌等有益菌生長(zhǎng)，并且其作用效果比其他寡糖更好（聶昌林和宋春陽(yáng)，2012）。當(dāng)前關(guān)于低聚木糖和益生菌改善斷奶仔豬腸道健康的報(bào)道較多，但有關(guān)寡糖和益生菌組合效應(yīng)的研究較少。低聚木糖作用的是腸道的雙歧桿菌和部分乳酸菌，和芽孢桿菌作用于腸道的方式和機(jī)制不同，兩者可能存在組合和協(xié)同效應(yīng)。為此，本試驗(yàn)在飼糧中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖，研究其對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)通透性及糞便微生物的影響，以探討兩者的組合和互作效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 地衣芽孢桿菌由滄州華雨生物科技有限公司提供，地衣芽孢桿菌含量為1011cfu/kg；低聚木糖由鶴壁泰新科技有限公司提供，低聚木糖含量為96.5%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)選取體重、健康狀況相近的（25±1）日齡“杜長(zhǎng)大”斷奶仔豬160頭，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭仔豬。試驗(yàn)采用2×2完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)置2個(gè)地衣芽孢桿菌水平組（0、400 mg/kg）和2個(gè)低聚木糖水平組（0、200 mg/kg）。飼養(yǎng)試驗(yàn)在河南雄峰科技股份有限公司滎陽(yáng)斯格豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)過(guò)渡期3 d，正式期28 d。豬只自由采食和飲水，其他按照該場(chǎng)正常的飼養(yǎng)管理和防疫流程進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)飼糧 試驗(yàn)飼糧為玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)均可以滿足斷奶仔豬的營(yíng)養(yǎng)需求（NRC，2012），基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 樣品采集與處理 在試驗(yàn)期內(nèi)每天對(duì)豬的采食量、余料量、腹瀉情況進(jìn)行收集及記錄。在試驗(yàn)第28天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇2頭仔豬，靜脈采血，分離血清，待測(cè)腸道通透性指標(biāo)；每個(gè)重復(fù)選取1頭、每組共5頭仔豬（體重接近窩平均體重），共屠宰20頭仔豬，按照常規(guī)方法進(jìn)行采樣，采集空腸中部2 cm腸段，用于檢測(cè)腸道形態(tài)；以肛門拭子采集各重復(fù)所有豬只的糞便樣品，然后各重復(fù)樣品合并，置于冰盒并迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室測(cè)定微生物區(qū)系。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定 每天記錄豬群的健康狀況，觀察是否有腹瀉，并作記錄。記錄豬群各重復(fù)的耗料量，在試驗(yàn)始、末分別于早晨空腹稱重，計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料肉比（F/G），并計(jì)算腹瀉率。

腹瀉率/%=[試驗(yàn)期內(nèi)腹瀉頭數(shù)/（試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)頭數(shù)）]×100。

1.5.2 腸道形態(tài)檢測(cè) 取2 cm空腸腸段，以載玻片輕輕刮去腸道食糜，用生理鹽水沖洗干凈，然后用濾紙吸干，置于10%中性福爾馬林固定液中固定，然后經(jīng)過(guò)脫水-透明-浸臘-包埋-修塊等處理后，制成5μm厚切片，用蘇木精-伊紅染色法染色。觀察測(cè)定絨毛高度（VH）、隱窩深度（CD），并計(jì)算兩者的比值（VH/CD）。

1.5.3 血清腸道通透性指標(biāo) 每頭仔豬靜脈采血10 mL，室溫下傾斜靜置1 h后，3000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃冰箱保存，待測(cè)血清腸道通透性指標(biāo)。D-乳酸含量和二胺氧化酶（DAO）用試劑盒（南京建成生物工程研究所）以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定。

1.5.4 腸道微生物指標(biāo) 將1 g混合糞樣以9 mL滅菌生理鹽水作梯度稀釋后測(cè)定活菌數(shù)。大腸桿菌采用麥康凱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h；乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48 h；細(xì)菌數(shù)量采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后用每克腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)lg（cfu/g）表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以重復(fù)為單位進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0軟件的ANOVA程序進(jìn)行兩因素方差分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較；所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”來(lái)表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響 由表2可知，與對(duì)照組相比，日糧中添加地衣芽孢桿菌組和低聚木糖組斷奶仔豬的平均日增重顯著提高15.1%和12.8%（P＜0.05），腹瀉率顯著降低34.1%和41.2%（P＜0.05）；日糧中添加地衣芽孢桿菌組斷奶仔豬的料肉比顯著降低10.6%（P＜0.05）；各組平均日采食量差異不顯著（P＞0.05）；同時(shí)添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和腹瀉率均無(wú)顯著互作效應(yīng)（P＞0.05）。

表2 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響

2.2 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響 由表3可知，與對(duì)照組相比，日糧中添加地衣芽孢桿菌組和低聚木糖組斷奶仔豬空腸的絨毛高度顯著提高20.3%和16.3%（P＜0.05），絨隱比顯著提高31.5%和20.7%（P＜0.05）；對(duì)于隱窩深度無(wú)顯著影響（P＞0.05）；同時(shí)添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬空腸的絨毛高度、隱窩深度和絨隱比均無(wú)顯著互作效應(yīng)（P＞0.05）。

表3 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

2.3 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響 由表4可知，日糧中添加地衣芽孢桿菌組斷奶仔豬血清D-乳酸和DAO水平較對(duì)照組顯著降低14.6%和19.1%（P＜0.05）；日糧中添加低聚木糖組斷奶仔豬血清D-乳酸和DAO水平較對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；同時(shí)添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬血清D-乳酸和DAO水平均無(wú)顯著互作效應(yīng)（P＞0.05）。

表4 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響

表5 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬糞便微生物的影響lg（cfu/g）

2.4 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬糞便微生物的影響 由表5可知，與對(duì)照組相比，日糧中添加低聚木糖組斷奶仔豬糞便乳桿菌數(shù)量顯著提高5.3%（P＜0.05）；日糧中添加地衣芽孢桿菌組和低聚木糖組斷奶仔豬糞便大腸桿菌數(shù)量顯著降低12.5%和9.4%（P＜0.05），并且兩者有顯著的互作效應(yīng)（P＜0.05）。

3 討論

3.1 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響 斷奶會(huì)導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)采食量下降、生長(zhǎng)緩慢和腹瀉等問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加地衣芽孢桿菌可顯著提高斷奶仔豬的平均日增重，降低料肉比。其他研究也表明，日糧中添加芽孢桿菌可以改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能（Chen等，2006）。益生菌對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響受益生菌種類、添加水平、日糧營(yíng)養(yǎng)、動(dòng)物日齡和健康狀況等多種因素的影響（Lee等，2014）。相比育肥階段，益生菌對(duì)于保育階段的仔豬可能更易產(chǎn)生顯著影響，因?yàn)榇藭r(shí)豬的消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善（Schweer等，2017）。本研究中日糧中添加地衣芽孢桿菌對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉的改善可能與腸道健康水平的提升有關(guān)。黃瑞華等（2007）和方桂友等（2015）報(bào)道，日糧中添加低聚木糖可改善斷奶仔豬的日增重和料肉比，降低腹瀉率，與本研究結(jié)果一致。有關(guān)益生菌和低聚木糖在斷奶仔豬中互作的研究較少，本研究未觀察到兩者對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的互作效應(yīng)。

3.2 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響 腸道形態(tài)的完整性直接關(guān)系到養(yǎng)分的吸收，還能影響腸道對(duì)有害物質(zhì)的屏蔽作用。腸道形態(tài)對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)很敏感，斷奶仔豬腸道絨毛破損萎縮、隱窩深度增加，絨隱比降低（任曼等，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖能改善斷奶仔豬的腸道絨毛形態(tài)損傷。其他研究也發(fā)現(xiàn)益生菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道絨毛形態(tài)具有修復(fù)作用（黃永潔等，2014；Ross等，2010）。仔豬斷奶時(shí)腸道微生物區(qū)系發(fā)生紊亂，有害微生物大量增殖，產(chǎn)生的毒素會(huì)造成腸道絨毛損傷（Zhu等，2012）。地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道絨毛形態(tài)的修復(fù)可能與其對(duì)腸道微生物的調(diào)節(jié)有關(guān)。而且腸道絨毛高度的增加會(huì)提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積，有利于改善生長(zhǎng)性能。

3.3 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響 腸道上皮的屏障功能對(duì)維持腸道及整個(gè)機(jī)體的健康有重要意義，當(dāng)腸道上皮屏障功能受損時(shí)，腸道有害微生物、毒素及其他有害物質(zhì)會(huì)入侵黏膜下層，甚至是血液和機(jī)體，嚴(yán)重?fù)p傷動(dòng)物的健康和生長(zhǎng)性能。正常情況下，DAO存在于動(dòng)物小腸黏膜上皮細(xì)胞中，D-乳酸是腸道多種細(xì)菌代謝和裂解的產(chǎn)物，兩者在血液中的含量很低。當(dāng)腸道黏膜屏障受損，腸黏膜細(xì)胞脫落入腸腔，或是腸道通透性異常升高時(shí)，腸道細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-乳酸穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，血液中的DAO或D-乳酸含量才會(huì)顯著升高。因此血DAO活性和D-乳酸是反映腸道應(yīng)激受損情況的關(guān)鍵敏感指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌能改善斷奶仔豬腸道通透性。Kang等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬日糧中添加益生菌可提高腸道修復(fù)因子的表達(dá)，這些因子在腸道上皮損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。另外，有研究表明益生菌能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白質(zhì)的表達(dá)及減少腸道上皮細(xì)胞的凋亡來(lái)增強(qiáng)腸道上皮的屏障功能，降低其通透性（Cui等，2017）。

3.4 地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬糞便微生物的影響 日糧中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖減少了斷奶仔豬糞便的大腸桿菌數(shù)量，添加低聚木糖增加了乳桿菌數(shù)量。這與地衣芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響一致。動(dòng)物腸道有大量微生物存在，腸道微生物區(qū)系的平衡與動(dòng)物健康和養(yǎng)分的消化吸收利用密切相關(guān)，斷奶應(yīng)激會(huì)破壞仔豬的腸道微生物區(qū)系。芽孢桿菌和低聚木糖可調(diào)節(jié)腸道微生物有較多報(bào)道（Thacker等，2013）。芽孢桿菌調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的可能機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)奪氧、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等（Elshaghabee等，2017）；低聚木糖可作為雙歧桿菌的代謝底物，能有效促進(jìn)腸道雙歧桿菌的增殖，而雙歧桿菌一般認(rèn)為對(duì)腸道健康有積極影響（Holscher，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌和低聚木糖在降低糞便大腸桿菌數(shù)量方面有互作效應(yīng)，這可能與兩者調(diào)節(jié)腸道微生物的機(jī)制不同，可能在調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系方面存在加和效應(yīng)有關(guān)。

4 結(jié)論

日糧中添加地衣芽孢桿菌和低聚木糖可以提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，降低腹瀉率，改善腸道絨毛形態(tài)，降低腸道通透性，改善糞便腸道微生物組成，并且在降低大腸桿菌數(shù)量方面有互作效應(yīng)。