楊路平,邵立君,王國玲,王錫寧,任曉菲,劉擁軍

(1.山東大學預防醫(yī)學研究院,山東濟南 250012;2.山東省疾病預防控制中心,山東濟南 250012;3.山東省醫(yī)學科學院藥物研究所,山東濟南 250062)

中國是世界上主要的食用菌生產(chǎn)國和出口國,食用菌也是中國農(nóng)業(yè)六大支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。食用菌生產(chǎn)過程具有密閉、潮濕和不見光等特點,病蟲害一直是影響食用菌生產(chǎn)和品質(zhì)的主要因素之一[1]。蘑菇褐腐病是危害蘑菇栽培業(yè)的世界性病害,覆蓋土的消毒滅菌和發(fā)病后噴施殺菌劑處理仍是目前防治該病害的主要措施,生產(chǎn)上曾先后使用過多種殺菌劑。其中,多菌靈已在蘑菇生產(chǎn)中應用多年,咪唑類殺菌劑咪鮮胺已獲準登記在蘑菇上使用,苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇屬甾醇合成抑制劑,是目前國內(nèi)生產(chǎn)和使用量較大的殺菌劑品種。雙翅目類害蟲也會危害食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)。化學防治仍是中國防治食用菌害蟲的主要方法,生產(chǎn)上經(jīng)常使用的殺蟲劑有氟蟲腈、阿維菌素、吡蟲啉、除蟲脲、擬除蟲菊酯類殺蟲劑及植物源農(nóng)藥等。而這些農(nóng)藥并未獲得中國農(nóng)業(yè)部批準應用于食用菌害蟲防治[2-4]。

國內(nèi)外對殺菌劑和殺蟲類農(nóng)藥殘留的研究集中在水[5]、食品[6-9]及水果中[10-11],常用的檢測方法包括氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12](GC-MS/MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17](LC-MS/MS)等。由Anastassiadas等于2003 年提出的快速(Quick)、簡單(Easy)、廉價(Cheap)、高效(Effective)、可靠(Rugged)和安全(Safe)的分散固相萃取(QuEChERS)技術(shù),最初用于果蔬中農(nóng)藥殘留檢測,后被推廣至更大的檢測范圍和基質(zhì)中,成為農(nóng)藥殘留快速前處理技術(shù)的首選[18-21]。

本實驗通過優(yōu)化QuEChERS各類填料的不同配比,優(yōu)化超高效液相色譜-質(zhì)譜條件,建立了同時測定蘑菇中常用13種農(nóng)藥殘留的QuEChERS-LC-MS/MS分析方法,用于蘑菇中13種農(nóng)藥殘留測定,為蘑菇食品安全評估檢測工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食用菌 按國家食品安全風險監(jiān)測標準要求于2018年6～7月在山東省17地市采集170份菌類制品,包括55份香菇,32份杏鮑菇,28份海鮮菇,41份金針菇,5份雞腿菇,9份白玉菇,樣品經(jīng)多功能粉碎機粉碎至勻漿后,密封冷凍備用；甲醇、乙腈 色譜純,德國Merker;無水硫酸鎂 國藥集團;N-丙基乙二胺(PSA)、C18、GCB 美國Agilent公司；農(nóng)藥標準品:多菌靈(carbendazim)、甲基硫菌靈(Thiophonate-methyl)、甲霜靈(metalaxyl)、嘧霉胺(pyrimethanil)、烯酰嗎啉(dimethomorph)、咪鮮胺(prochloraz)、三唑酮(triadimefon)、苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)、丙環(huán)唑(propiconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、吡蟲啉(imidachloprid)、啶蟲脒(acetamiprid)和氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole) 均購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

UPLC XevoTMTQ-S超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司;460/H超聲波清洗器 德國Elma公司;HR2860食品粉碎機 Philips公司;Vortex-Genie2渦旋混勻器 美國Scientific公司,Millipore超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司,Sartorius CPA225D電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取 5.0 g 食用菌勻漿(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中,加入15 mL乙腈-水(4∶1,V/V),超聲250 W提取5 min,加入1 g氯化鈉,振蕩0.5 min,待液液分層后加入4 g無水硫酸鎂,振蕩渦旋1 min,10000 r/min室溫離心5 min,取上清液1.0 mL,加30.0 mg PSA+15.0 mg無水硫酸鎂 渦旋混勻1 min,在10000 r/min室溫離心3 min。取上清液,過0.22 μm濾膜,LC-MS/MS進樣分析。

1.2.2 標準溶液的配制及標準曲線的繪制 標準儲備液的配制:分別準確稱取適量的13種農(nóng)藥標準品,用丙酮溶解,配成質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的標準儲備液,于-18 ℃下保存,備用。

混合標準儲備液的配制:分別準確量取1.0 mL標準儲備液于100 mL容量瓶中,用丙酮稀釋并定容,配成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的混合農(nóng)藥標準儲備液,于-18 ℃下保存,備用。

基質(zhì)匹配標準溶液的配制:取未檢出農(nóng)藥殘留的食用菌勻漿,依1.2.1法處理,得到待進樣清液,作為空白基質(zhì)溶液。用基質(zhì)空白溶液稀釋混合標準儲備液,分別配成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.025、0.05、0.1和 0.2 mg/L的標準工作溶液。以13種農(nóng)藥的標準工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標,各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標,繪制各物質(zhì)的基質(zhì)匹配標準曲線。

1.2.3 儀器條件的優(yōu)化

1.2.3.1 色譜柱的選擇 本試驗考察了BEH C18、HSS T3兩種色譜柱對目標化合物色譜行為的影響。

1.2.3.2 流動相的選擇 本試驗對不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液)進行了考察。

1.2.3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用直接進樣方式,分別對濃度為0.5 mg/L的13種農(nóng)藥標準溶液做正離子和負離子全掃描分析,以獲得豐度較高的母離子。在此基礎上,對各待測物的母離子進行子離子掃描,選取響應最強的兩對MRM離子對,分別作為定量離子對和定性離子對,軟件自動優(yōu)化其Q1、Q3偏置電壓及碰撞能等質(zhì)譜參數(shù),使子離子的響應達到最佳。

1.2.4 樣品前處理的優(yōu)化

1.2.4.1 萃取溶劑的選擇 取已制備的蘑菇樣品加標后進行前處理,在萃取過程中,分別考察甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-水、乙腈-水混合溶液作為提取溶劑的提取回收率。

1.2.4.2 凈化劑的選擇 取已制備的蘑菇樣品加標后進行前處理,在萃取液凈化過程中,分別考查PSA和無水硫酸鎂對13種農(nóng)殘回收率的影響。

1.2.5 色譜質(zhì)譜條件 色譜條件:ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流動相A為0.1%甲酸溶液,B為乙腈,梯度洗脫:B相在1.0 min內(nèi)線性由10%增加到50%,1～2.5 min由50%增加到60%,2.5～8 min由60%增加到95%,然后在0.5 min內(nèi)降至10%,保持2.0 min;流速0.3 mL/min,進樣量5.0 μL,柱溫:35 ℃。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源正離子模式;多反應監(jiān)測;毛細管電壓:2.0 kV;萃取錐孔電壓:20 V;RF透鏡電壓:0.5 V;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;錐孔氣流速:50 L/h;脫溶劑氣流速:800 L/h;倍增器電壓:650 V;二級碰撞氣:氬氣;13種農(nóng)藥串聯(lián)質(zhì)譜多反應監(jiān)測模式下的檢測條件見表1。

表1 13種農(nóng)藥多反應監(jiān)測模式下的檢測條件Table 1 Multiple reaction monitoring conditions for the determination of 13 pesticides

1.2.6 標準曲線的繪制及回收率測定 由于蘑菇復雜基質(zhì)的影響,采用基質(zhì)匹配法繪制標準曲線能更好的消除ME對定量的影響。取未檢出農(nóng)藥殘留的食用菌為空白樣品,按照1.2.1的前處理方法,制備成母液。在上述制備母液中添加混合標準溶液,形成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、200 μg/L的基質(zhì)標準液,經(jīng)UPLC-MSMS分析后,以13種農(nóng)殘的標準溶液濃度x(μg/L)為橫坐標,各自定量離子的峰面積y為縱坐標,繪制校正曲線。取未檢出農(nóng)藥殘留的食用菌為空白樣品,進行添加回收率和精密度試驗,分別添加0.05,0.25和1.0 μg三個質(zhì)量濃度的13種農(nóng)藥混合標準溶液適量,使樣品中最終濃度為0.01,0.05和0.2 mg/kg,混勻,靜置30 min,使標準溶液被空白樣品充分吸收,依1.2.1法進行前處理和測定,每個濃度測定5次,計算其平均加標回收率和相對標準偏差(RSD%)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Masslynx software V 4.1(Waters,USA)軟件進行數(shù)據(jù)采集及處理,Excel 2017進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 本試驗考察了BEH C18、HSS T3兩種色譜柱對目標化合物色譜行為的影響。由圖1可見相對于BEH C18柱,HSS T3柱獲得較好的分離效果,圖1以T3柱保留時間為4.51 min丙環(huán)唑為例,其C18柱保留時間為4.17 min,但4.23 min處出現(xiàn)肩峰,使用HSS T3柱,目標化合物的峰形更好,響應更高,基線噪音更低,因此本試驗選擇HSS T3柱為分析柱。

圖1 BEH C18、HSS T3色譜柱的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of HSS T3 column and BEH C18注:a為丙環(huán)唑在T3柱的提取離子流圖；b為丙環(huán)唑在C18柱的提取離子流圖；c為13種農(nóng)殘在T3柱的總離子流圖；d為13種農(nóng)殘在C18柱的總離子流圖。

2.1.2 流動相條件的優(yōu)化 通過比較不同流動相體系(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液,結(jié)果顯示0.1%甲酸的加入使13種待測物在較短時間內(nèi)實現(xiàn)了更好的分離,得到了理想的靈敏度和分辨率,峰形良好,采用乙腈為有機相時,與甲醇比較,目標化合物具有更高的靈敏度和更好的分離度,因此本試驗采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相梯度洗脫。優(yōu)化后的混合標準溶液的總離子流色譜圖見圖2,13種化合物的提取離子流圖見圖3。

圖2 混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of mixed standard solution

圖3 13種化合物的提取離子流圖Fig.3 Ion chromatogram of 13 compounds注:a表示相對豐度。

2.1.3 UPLC-MS/MS 條件優(yōu)化 通過對質(zhì)譜條件的優(yōu)化,所采用的參數(shù)見表1。結(jié)果表明13種農(nóng)殘都具有較高的質(zhì)譜響應,滿足實驗要求的靈敏度。

2.2 樣品前處理方法的考察

2.2.1 萃取溶劑的選擇 通過比較甲醇、乙腈以及不同比例的甲醇-水、乙腈-水混合溶液作為提取溶劑的提取回收率,結(jié)果見圖4,由圖可見乙腈-水作為提取溶劑時13種農(nóng)藥的回收率在85%～105%之間,比甲醇-水作為提取溶劑的回收率高出8%以上,乙腈的體積分數(shù)達到75%～80%時,提取效率最高,因此選擇乙腈-水(4∶1,V/V)作為提取溶劑。

圖4 采用不同提取溶劑所得到13種農(nóng)藥的回收率Fig.4 Recoveries of 13 pesticides with different extraction solvents

2.2.2 凈化劑的選擇 QuEChERS凈化法是近年來國際上最新發(fā)展起來的具有快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全等特點的樣品前處理技術(shù),一般采用PSA、C18和GCB等吸附劑進行樣品凈化。PSA可用于去除各種有機酸、色素及一些糖類和脂肪酸;C18可用于去除脂肪類化合物;GCB可用于去除類甾體、葉綠素等色素。該試驗對比了混合標準溶液經(jīng)過PSA、C18和GCB三種不同吸附劑和未使用吸附劑時的回收率見圖5,發(fā)現(xiàn)PSA對13種農(nóng)藥的回收率均較好,在70%以上,這可能是因為PSA吸附劑具有弱的陰離子交換能力,有利于吸附樣品基質(zhì)中的有機酸、糖和色素,對農(nóng)藥有較高的回收率。而其他2種吸附劑凈化后的農(nóng)藥回收率較低,因此,本試驗選擇PSA作為QuEChERS凈化的吸附劑,并添加了無水硫酸鎂粉末,起到除水的作用。本文考察了PSA的使用量(20.0、30.0和40.0 mg),結(jié)果見圖6,表明PSA的使用量對基質(zhì)效應沒有顯著的影響(53.4%、48.2%和47.2%),回收率結(jié)果見圖7,回收率隨著PSA用量的增加略有降低(87.4%、85.6%和80.5%),所以我們選用30.0 mg PSA。我們比較了三種組合:a.30.0 mg PSA+10.0 mg無水硫酸鎂;b.30.0 mg PSA+15.0 mg無水硫酸鎂;c.30.0 mg PSA+20.0 mg無水硫酸鎂;平均回收率見圖8,沒有顯著區(qū)別(86.7%、87.4%和85.9%),最終選用30.0 mg PSA+15.0 mg無水硫酸鎂。

圖5 不同凈化劑對回收率的影響Fig.5 Effect of different purificant on recovery

圖6 PSA的不同用量對13種農(nóng)殘基質(zhì)效應的影響Fig.6 Effects of different dosage of PSA on matrix effects of 13 kinds of pesticide residues

圖7 PSA的不同用量對13種農(nóng)殘回收率的影響Fig.7 Effects of different dosage of PSA on recovery rate of 13 kinds of pesticide residues

圖8 無水硫酸鎂的不同用量對13種農(nóng)殘回收率的影響Fig.8 Effects of different dosage of MgSO4 on recovery rate of 13 kinds of pesticide residues

2.3 基質(zhì)效應、工作曲線及檢出限

基質(zhì)效應的存在對準確檢測有著不可忽視的影響,試驗中以ME=Slopi/Slop0評價基質(zhì)效應,其中ME為基質(zhì)效應,Slopi為基質(zhì)匹配標準曲線的斜率,Slop0為純?nèi)軇藴是€的斜率。當ME在0.90～1.10之間時,基質(zhì)效應可以不考慮;當ME大于1.10 時,為基質(zhì)增強效應;當ME小于0.90時,為基質(zhì)抑制效應。以空白蘑菇為基質(zhì),結(jié)果表明,除了甲霜靈、嘧霉胺、三唑酮三種殺菌劑外其他10種農(nóng)藥均有不同程度的基質(zhì)抑制效應,見表2。因此,在試驗中采用基質(zhì)匹配標準曲線以減少基質(zhì)效應對試驗結(jié)果的影響。配制13種農(nóng)藥系列混合標準溶液進行測定,以峰面積(y)對濃度(x,μg/L)進行線性回歸,其線性關(guān)系良好,以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分別確定檢出限(LOD)與定量限(LOQ)。方法的線性范圍0.5～200 μg/L,LOD與LOQ見表2所示,結(jié)果表明,13種目標化合物在所選定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)相關(guān)系數(shù)在0.9991～0.9999之間,檢出限在0.03～0.3 μg/kg之間,定量限在0.1～1 μg/kg之間。

表2 13種農(nóng)藥基質(zhì)匹配曲線線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits of 13 pesticides

2.4 方法的回收率與精密度

取未檢出農(nóng)藥殘留的食用菌為空白樣品,進行添加回收率和精密度試驗,依1.2.6法進行前處理和測定,結(jié)果見表3,13種農(nóng)藥的加標回收率在84.3%～102%之間,測定值的相對標準偏差在2.8%～6.3%之間。

表3 13種殺菌劑的添加回收率和相對標準偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of 13 fungicides(n=5)

2.5 實際樣品分析

按試驗方法對山東省17地市采集的170份食用菌進行分析,其檢出結(jié)果見表4,其中“/”表示未檢出。13種農(nóng)藥殘留中的8種有檢出,檢出率最高的是多菌靈,為45.3%;其次是烯酰嗎啉為28.8%;三唑酮、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、甲霜靈五種均未檢出。GB2763-2016食品中農(nóng)藥最大殘留限量中,規(guī)定咪鮮胺在蘑菇類的限量為2 mg/kg,對本試驗中其他12種農(nóng)藥目前還沒有相關(guān)檢測方法和殘留的限量規(guī)定。本實驗咪鮮胺的檢出率為13.5%,樣品中最大值為5.4 μg/kg,所有樣品均小于2 mg/kg的限量規(guī)定。

表4 13種農(nóng)藥殘留在170份菌類樣品中的檢出率及濃度范圍Table 4 Detection rate and concentration rage of 13 pesticide residues in 170 fungus samples

3 結(jié)論

本工作建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食用菌中13種殺蟲殺菌劑的方法。與傳統(tǒng)檢測方法相比,樣品前處理過程簡單,試劑消耗量少、樣品分析成本低。此外,分散固相萃取技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)用使得信噪比更高、干擾更少,其LOQ可達到0.1 μg/kg,在實際檢測中具有較強的可行性和實用性,可滿足菌類樣品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測要求。GB2763-2016食品安全國家標準-食品中農(nóng)藥最大殘留限量[22],標準只對食用菌(鮮蘑菇)中的20種農(nóng)藥殘留有相關(guān)的限量規(guī)定[18],而市場上的農(nóng)藥有上百種可能被用于蘑菇種植中以起到殺菌和殺蟲作用,因此建立完善食用菌中多種農(nóng)藥殘留的檢測方法和限量標準的制定是十分必要的。實驗所得170份食用菌中13種農(nóng)藥殘留數(shù)據(jù)為政府監(jiān)督部門制定食品安全標準提供了數(shù)據(jù)支持。