姚軼俊 張 晶 鞠興榮 王立峰

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心1，南京 210023)(江南大學(xué)食品學(xué)院2，無錫 214122)

眾多研究認(rèn)為食物蛋白來源的抗氧化肽類物質(zhì)是一類安全性較高的抗氧化劑。目前，國內(nèi)外學(xué)者從不同來源的蛋白質(zhì)中制備出了具有各種活性的肽類物質(zhì)，但這些研究主要集中在制備工藝、分離純化、功能鑒定及構(gòu)效關(guān)系等方面[1-3]，而有關(guān)加工儲藏條件對多肽活性的影響卻研究較少[4]。多肽作為蛋白質(zhì)的降解衍生物，性質(zhì)與蛋白質(zhì)類似，都很容易受到環(huán)境因素的影響，如在生產(chǎn)、加工及儲藏過程中可能會因氧化、脫酰胺、水解或環(huán)化等作用而發(fā)生降解，導(dǎo)致其活性下降甚至完全喪失，這將影響到肽類產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用，所以研究多肽類物質(zhì)穩(wěn)定性存在的環(huán)境條件可以為多肽的生產(chǎn)加工提供參考[4]。

劉丹[5]分析了大豆多肽的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示高溫、金屬離子和強(qiáng)堿性環(huán)境不利于多肽活性的保持，同時(shí)添加的少量的檸檬酸可以使此多肽羥基自由基清除活性增強(qiáng)。此外，在胃腸道消化過程中多肽很可能會受到胃腸液中的胃蛋白酶、胰蛋白酶以及食物消化過程中產(chǎn)生的Fe、Cu、H2O2、NO、血紅素、脂質(zhì)過氧化物等物質(zhì)的影響，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失活。朱淑云等[6]考察了水飛薊粕蛋白酶解物的穩(wěn)定性，結(jié)果表明添加食鹽、蔗糖、葡萄糖等對DPPH自由基清除活性影響不大，但經(jīng)胃液消化后DPPH自由基清除活性明顯降低，經(jīng)腸液消化后后DPPH自由基清除活性增強(qiáng)。陳亮等[7]研究了溫度、pH及腸胃環(huán)境對玉米低聚肽穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示溫度及pH對多肽的穩(wěn)定性影響較小，基本上不受腸胃消化環(huán)境的影響，能保持較高的生物活性。賈俊強(qiáng)等[8]考察了溫度、pH、干燥方式和體外腸道酶消化對蠶蛹源 ACE 抑制肽穩(wěn)定性的影響，分析發(fā)現(xiàn)此多肽在高溫、酸性和堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，易失活，冷凍和噴霧兩種干燥方式對多肽的活性影響很小，同時(shí)此多肽具有較強(qiáng)的耐蛋白酶消化的能力。因此，研究多肽在加工、儲藏及胃腸道中的穩(wěn)定性，對于理論和實(shí)踐方面有重要意義。

本研究以Alcalase 2.4L酶解“雙低”油菜籽寧雜19號得到的菜籽蛋白酶解物(rapeseed protein hydrolysate，RPH)為原料，通過超濾和凝膠色譜分離其活性肽組分，對酶解液及各分離組分進(jìn)行抗氧化活性研究及多肽序列鑒定，發(fā)現(xiàn)抗氧化肽WDHHAPQLR具有較高的抗氧化活性，可作為一種天然抗氧化劑應(yīng)用于食品加工中，同時(shí)還可以作為功能性食品添加劑[9]。然而作為食品添加劑，其在食品儲藏過程及其在人體內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定性研究都顯得尤為重要。因此在前期研究的基礎(chǔ)上，研究食品環(huán)境如pH、食品配料成分、金屬離子、防腐劑以及模擬利用過程中體外胃腸消化等因素對菜籽抗氧化肽WDHHAPQLR穩(wěn)定性的影響，旨在為菜籽抗氧化肽作為抗氧化劑在后續(xù)試驗(yàn)、生產(chǎn)、儲藏及功能性利用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽肽WDHHAPQLR由實(shí)驗(yàn)室利用Alcalase 2.4 L水解菜籽蛋白后得到菜籽蛋白水解物，并經(jīng)過超濾膜分離、凝膠色譜(Sephadex G-15)和RP-HPLC分離純化制得[9]。

菲洛嗪、DPPH、蔗糖、檸檬酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、胃蛋白酶、胰蛋白酶；NaCl、CuSO4、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、KCl、NaOH、HCl等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、PHS-3C雷磁pH計(jì)、Milli-Q純水機(jī)、SpectraMax M2e酶標(biāo)儀、QL-861漩渦振蕩器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DPPH·自由基清除活性的測定

用無水乙醇配制0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別取2 mL不同濃度(2，4，6，8 mg/mL)的樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光值。用VC作為陽性對照。樣品對DPPH自由基的清除率按照式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0表示2 mL無水乙醇+ 2 mL DPPH溶液的吸光值；A1表示2 mL樣品溶液+ 2 mL DPPH溶液的吸光值；A2表示樣品溶液+ 2 mL無水乙醇的吸光值。

1.3.2 Fe2+-螯合金屬離子能力的測定

實(shí)驗(yàn)方法參照Dinis的相關(guān)文獻(xiàn)[10]，并進(jìn)行了一定的修改。用蒸餾水分別配制濃度為2 mmol/L的FeCl2溶液和5 mmol/L ferrozine溶液；將1 mL待測溶液與0.05 mL FeCl2溶液、0.2 mL ferrozine溶液混合均勻，室溫下放置10 min，測定溶液在562 nm下的吸光值。對照組以去離子水代替樣品，同時(shí)每組設(shè)置5個(gè)平行。Fe2+-螯合金屬離子能力按照式(2)計(jì)算：

Fe2+-螯合金屬離子能力=(A0-A1)/A0×100%

(2)

式中：A0表示對照組的光密度值；A1表示樣品的光密度值。

1.3.3 抗氧化肽活性保持率計(jì)算

分別測定菜籽抗氧化肽處理前的DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力A0，然后測定經(jīng)不同處理后的DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力A1，按式(3)計(jì)算：

活性保持率=A1/A0×100%

(3)

1.3.4 溫度對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，分別放置于20、40、60、80、100 ℃的水浴鍋中保存1 h后冷卻至室溫分別測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.5 pH對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，分別調(diào)pH值為2、4、6、8、10、12，在室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.6 食品配料成分對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，在溶液分別添加NaCl、檸檬酸、蔗糖。其中，NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%；檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%；蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%；室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.7 金屬離子對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，分別添加50、100、150、200、250 μg/mL的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+，室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.8 防腐劑對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液，在溶液中分別添加苯甲酸鈉和山梨酸鉀，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%，室溫下放置1 h后測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.3.9 胃-腸道蛋白酶對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

配制1 mg/mL的菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)溶液。實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[11]，并進(jìn)行了一定的修改。胃蛋白酶消化：用1 mol/LHCl將肽液的pH值調(diào)至2.0，加入4%的胃蛋白酶在37 ℃下水浴2 h后，煮沸10 min終止消化，冷卻至室溫后離心(10 000 g，10 min)，將上清液分為2份，一份測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力，另一份繼續(xù)用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化：將胃蛋白酶消化后的上清液的pH值調(diào)至7.5，加入4%的胰蛋白酶在37 ℃下水浴2 h后，煮沸10 min終止消化，冷卻至室溫后離心(10 000 g，10 min)，收集上清液，測定其DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

溫度對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖1所示，在20～60 ℃時(shí)，DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力的保持率先上升后下降，但是變化幅度不大，活性保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)；在60～80 ℃時(shí)，活性保持率急劇下降，在溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，F(xiàn)e2+-螯合金屬離子能力活性保持率僅在30%左右。只有一些分子質(zhì)量大于等于50 ku的蛋白質(zhì)可以形成四級結(jié)構(gòu)，所以分子質(zhì)量較小的一些短肽不具備三級和四級結(jié)構(gòu)[12]，但是這些短肽仍然可以形成二級結(jié)構(gòu)，這也是抗氧化肽具有活性的重要影響因素。處理溫度過高、時(shí)間過長可能會使抗氧化肽的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致活性大幅度下降。

圖1 溫度對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.2 pH對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

pH對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖2所示，抗氧化肽在中性環(huán)境(pH為6～8)時(shí)，具有較高的DPPH·自由基清除活性和Fe2+-螯合金屬離子能力保持率。在酸性和堿性環(huán)境中都會使得抗氧化肽的活性大幅度降低，從下降的趨勢中可以看出堿性環(huán)境的影響更為明顯。一般來說，每一個(gè)多肽都有其最適的酸堿范圍，在此范圍內(nèi)抗氧化肽的活性和結(jié)構(gòu)可以保持相對穩(wěn)定[13]，這表明該抗氧化在應(yīng)用時(shí)應(yīng)避免過酸或過堿的環(huán)境。

圖2 pH值對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.3 食品配料成分對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

NaCl、蔗糖和檸檬酸對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如表1所示。從表1中可以看出，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～6%范圍內(nèi)時(shí)，DPPH自由基清除活性保持率先上升后下降，但是變化幅度較小，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí)，活性保持率較高為93.89%，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時(shí)，活性明顯下降，保持率為86.33%；在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，NaCl含量對Fe2+-螯合能力影響不明顯，活性保持率均在90%以上；因此，可以推斷在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于6%時(shí)，對菜籽抗氧化肽的穩(wěn)定性無顯著影響。原因可能是中性鹽NaCl在水溶液中電離的Na+和Cl-能中和菜籽肽表面的大量電荷，破壞水化膜從而影響其抗氧化活性[14-16]。在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～10%范圍內(nèi)時(shí)，菜籽抗氧化肽的DPPH自由基清除活性隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而大幅度下降，在蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%時(shí)，活性保持率僅為70.27%；而蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～8%范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)e2+-螯合能力的也隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著下降，但是當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8%～10%時(shí)，活性保持率則趨于穩(wěn)定。原因可能是蔗糖不屬于還原性糖，而且常溫條件下蔗糖也無法水解。因此，蔗糖與菜籽肽無法發(fā)生美拉德反應(yīng)而使肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而對抗氧化活性沒有明顯影響[17-19]。在檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.02%～0.16%范圍內(nèi)時(shí)，對DPPH自由基清除活性和Fe2+-螯合能力的影響均不明顯，其活性保持率始終在90%以上。

表1 食品配料對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.4 金屬離子對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

金屬離子(K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+)對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖3所示，從圖中可以看出不同金屬離子對菜籽抗氧化肽的活性作用效果不同。其中，對DPPH自由基清除活性的的影響順序?yàn)閆n2+>Cu2+>Ca2+>Mg2+>K+(圖3a)。當(dāng)金屬離子濃度為250 μg/mL時(shí)，K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+溶液的活性保持率分別為(83.91±1.70)%、(58.42±0.86)%、(80.68±2.35)%、(51.93±1.46)%和(55.17±1.62)%，表明金屬離子會顯著地降低菜籽抗氧化肽的DPPH自由基清除活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)K+和Mg2+對菜籽抗氧化肽活性的影響效果較小。同理，圖(3b)中金屬離子對Fe2+-螯合金屬離子能力的影響順序?yàn)镃u2+> Zn2+> Mg2+>Ca2+> K+。當(dāng)金屬離子濃度為250 μg/mL時(shí)，K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+溶液的活性保持率分別為(85.37±0.86)%、(80.54±2.37)%、(63.44±1.67)%、(46.02±1.24)%和(41.72±0.74)%，表明Zn2+和Cu2+對菜籽抗氧化肽的Fe2+-螯合金屬離子影響較大。因此，菜籽抗氧化肽的加工和保存過程中要減少與富含Zn2+和Cu2+的材料的接觸。

圖3 金屬離子對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.5 防腐劑對抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

苯甲酸鈉和山梨酸鉀是食品中常用的防腐劑，其對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如圖4、5所示。在我國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的使用量范圍內(nèi)，苯甲酸鈉和山梨酸鉀對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)的活性保持率影響作用均不明顯；當(dāng)防腐劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.16%時(shí)，活性保持率在90%以上，這說明菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性對苯甲酸鈉和山梨酸鉀穩(wěn)定，在該產(chǎn)品生產(chǎn)中可用作防腐劑。

圖4 苯甲酸鈉對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

圖5 山梨酸鉀對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

2.6 胃-腸道蛋白酶對菜籽抗氧化肽穩(wěn)定性的影響

胃蛋白酶、胰蛋白酶對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性變化的影響如表2所示，在經(jīng)過2 h的胃蛋白酶消化后，抗氧化肽液的活性明顯增強(qiáng)，這可能是因?yàn)槲傅鞍酌笇㈦亩嗡獬尚∑危沟秒亩蔚囊恍﹥?nèi)部基團(tuán)暴露出來，例如一些疏水性基團(tuán)，而疏水性基團(tuán)可以顯著的增強(qiáng)抗氧化肽和不飽和脂肪酸之間的反應(yīng)，提高抗氧化肽的活性[19-20]。然而，在使用胰蛋白酶進(jìn)一步水解后，抗氧化肽液的活性明顯下降。由于抗氧化肽的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，目前還無法確定在水解過程中有哪些結(jié)構(gòu)被改變，因此還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的探究。

表2 胃腸道蛋白酶對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)活性的影響

3 結(jié)論

以DPPH·自由基清除活性、Fe2+-螯合金屬離子能力為指標(biāo)來考察溫度、酸堿度、食品配料成分、金屬離子、防腐劑和人工胃腸液等環(huán)境因素對菜籽抗氧化肽(WDHHAPQLR)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，抗氧化肽的活性逐漸降低，但還是保持在較高水平，但是當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，菜籽抗氧化肽的活性顯著降低，溫度為100 ℃時(shí)，F(xiàn)e2+-螯合金屬離子能力活性保持率僅在30%左右。強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境對抗氧化肽的穩(wěn)定性影響較大，當(dāng)溶液的pH在6.0～8.0范圍內(nèi)時(shí)，活性較為穩(wěn)定。抗氧化肽溶液的活性隨著食鹽濃度的增大而有所降低，當(dāng)食鹽的濃度達(dá)到8%時(shí)，抗氧化肽的活性保持率為86.33%。蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%～8%范圍內(nèi)時(shí)，菜籽抗氧化肽的活性隨蔗糖含量的增加而顯著下降，在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到8%，活性保持率在80%以上。在0.02%～0.16%范圍內(nèi)，檸檬酸對菜籽抗氧化肽的活性影響不大，其活性保持率均在90%以上。常見的金屬離子對菜籽抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不一，Cu2+和Zn+對菜籽抗氧化肽的DPPH·自由基清除活性和亞鐵離子螯合能力的影響最為顯著。苯甲酸鈉和山梨酸鉀對抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不明顯，可以在多肽產(chǎn)品中作為防腐劑使用；菜籽抗氧化肽溶液經(jīng)過胃蛋白酶消化后抗氧化活性顯著增加，再經(jīng)過胰蛋白酶消化后活性大幅度下降。然而由于抗氧化肽的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，目前還無法確定在水解過程中有哪些結(jié)構(gòu)被改變，因此還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)從模擬消化、小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等方面進(jìn)一步的探究。