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(1.包頭醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014040； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所， 呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古眾維實業(yè)有限責任公司， 呼和浩特 010110)

肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY. C. Ma)為列當科(Orobanchaceae)肉蓯蓉屬(Cistanche)多年生草本植物，現(xiàn)已被收入《國際野生植物保護名錄》和瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(CITES)附錄二，同時也是國家二級保護植物。其干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖是我國西北荒漠地區(qū)的特色名貴中藥材，性味甘、咸，溫，具有補腎陽，益精血，潤腸通便的功效，常用于腎陽不足，精血虧虛，陽痿不孕，腰膝酸軟，筋骨無力，腸燥便秘等癥，為補腎壯陽、潤腸通便之要藥，有“沙漠人參”的美譽[1]。近年來，內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、寧夏等省區(qū)紛紛結(jié)合生態(tài)建設(shè)開展肉蓯蓉人工種植和野生撫育，人工栽培面積逐年擴大。但由于其種子具有休眠性及寄生植物的生物學(xué)特性，在生產(chǎn)中萌發(fā)率和接種率均較低。另外，種源缺乏、種子質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)狀，也嚴重影響了肉蓯蓉的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。藥以種為本，種以優(yōu)為先，隨著中藥材種子質(zhì)量管理的不斷深化，制定肉蓯蓉種子標準，規(guī)范種子生產(chǎn)經(jīng)營秩序，對提高肉蓯蓉種子質(zhì)量，促進肉蓯蓉產(chǎn)業(yè)化健康發(fā)展具有十分重要的意義。因此，以肉蓯蓉種子為研究對象，結(jié)合種子的生理和生殖特性，初步建立種子質(zhì)量標準，并對其科學(xué)性和合理性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014年6月至2017年10月，采集寄生于藜科小喬木梭梭(HaloxylonammodendronBunge)根部的肉蓯蓉的成熟種子27份，經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院李旻輝教授鑒定為肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY. C. Ma)植物的種子。所有種子均過0.7 mm篩，并于4 ℃冰箱保存待用。種子收集情況詳見表1。

1.2 方 法

1.2.1種子外觀形態(tài)觀測

每份樣品取成熟的肉蓯蓉種子若干粒，于連續(xù)變倍體視顯微鏡(SZ 760)下觀察種子形態(tài)，并測量種子大小。

1.2.2凈度測定

每份樣品隨機抓取一把肉蓯蓉種子，倒在光潔的桌面上，平均分成4份，隨機選取其中的3份種子分別稱重，將凈種子、廢種子和雜質(zhì)分開后再分別稱重，取其平均值，即得種子凈度。

表1 肉蓯蓉種子樣品信息

樣品編號產(chǎn)地 樣品編號產(chǎn)地 1新疆昌吉回族自治州木壘縣15新疆巴音郭楞蒙古自治州且末縣2新疆昌吉回族自治州吉木薩爾縣16內(nèi)蒙古阿拉善右旗塔木蘇地區(qū)3新疆和田地區(qū)于田縣17內(nèi)蒙古阿拉善右旗阿拉藤朝克蘇木地區(qū)4甘肅省酒泉市瓜州縣18內(nèi)蒙古阿拉善右旗阿拉騰敖包鎮(zhèn)5甘肅省武威市民勤縣19內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特后旗6甘肅省張掖市臨澤縣20內(nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣7內(nèi)蒙古阿拉善左旗吉蘭泰鎮(zhèn)21內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣8內(nèi)蒙古阿拉善左旗敖倫布拉格地區(qū)22新疆阿克蘇地區(qū)沙雅縣9內(nèi)蒙古阿拉善左旗銀根蘇木地區(qū)23新疆霍城縣清水河鎮(zhèn)10甘肅省張掖市高臺縣24新疆阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣11寧夏永寧縣25內(nèi)蒙古額濟納旗賽漢陶來地區(qū)12內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗26內(nèi)蒙古額濟納旗巴彥陶來蘇木地區(qū)13新疆塔城地區(qū)裕民縣27內(nèi)蒙古額濟納旗達來呼布鎮(zhèn)14新疆阿克蘇地區(qū)阿克蘇市

圖1 肉蓯蓉種子的外觀形態(tài)圖

1.2.3種子生活力測定

每份樣品從經(jīng)凈度分析后并充分混合的凈種子中，取樣3個重復(fù)，每個重復(fù)100粒；將種子在10-4M赤霉素(20 ℃)中預(yù)濕8 h，染色前用鑷子從種孔處，將胚輕輕擠出2/3，然后將種子置 0.5%四氮唑(TTC)溶液中，于 35 ℃恒溫避光染色18 h 后取出，迅速用自來水沖洗，至洗出的溶液為無色為止。根據(jù)種子染色情況，記錄有活力及無活力種子數(shù)量，計算生活力，并取其平均值，即為樣品的生活力。

1.2.4含水量測定

每份樣品稱取種子3份，置于已恒重的稱量瓶稱重，每份約1 g，將樣品攤平均勻后放入烘箱中；待烘箱溫度上升至(130±2)℃后開始計時，烘干12 h；在烘箱內(nèi)將稱量瓶蓋子蓋好，取出后迅速放入干燥器中冷卻30 min，精密稱定重量，再按上述條件下干燥2 h，取出，置干燥器中，室溫冷卻30 min，精密稱定重量，至連續(xù)2次干燥后稱重的差異在5 mg以下為止。記錄此時的重量，放在干燥器中備用。

水分(%)=[(W1+W2)-W3]/W1×100%;

式中：W1為供試品的重量(g)；W2為稱量瓶恒重的重量(g)；W3為(稱量瓶+供試品)干燥至連續(xù)2次稱重的差異不超過5 mg后的重量(g)。

1.2.5千粒重測定

每份樣品取凈種子混合均勻，從中隨機取樣3個重復(fù)，每個重復(fù)1 000粒；將3個重復(fù)分別稱重，結(jié)果精確到0.01 mg，記錄數(shù)據(jù)，取其平均值，即為樣品的千粒重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子外觀形態(tài)觀測結(jié)果

采用GB/T 3543.5中6.2.1形態(tài)鑒定法。經(jīng)觀察分析，肉蓯蓉種子為褐色、黑褐色蒴果，橢圓形、長圓形或長方形，多為一頭鈍圓一頭尖；長0.8～1.3 mm，寬0.4～0.8 mm；種皮表面具有蜂窩狀紋飾。種子外觀形態(tài)見圖1。

2.2 種子凈度、生活力、含水量和千粒重測定結(jié)果

肉蓯蓉為寄生性植物，種子的萌發(fā)必須滿足其胚根在有限的時間和空間范圍內(nèi)與寄主根部維管束連接，才能順利實現(xiàn)從自養(yǎng)階段向寄生階段的過渡。由于自養(yǎng)階段的肉蓯蓉種子主要依靠自身貯藏營養(yǎng)生存，貯存營養(yǎng)越多，種子胚根生存的時間越長，延伸的空間范圍越廣，更有利于完成寄生過程。因此，在評定肉蓯蓉種子質(zhì)量時，種子凈度和含水量為種子收購和貯藏的主要指標，種子的千粒重和生活力為種子質(zhì)量分級的重要參考標準。本試驗用27份肉蓯蓉種子進行凈度、生活力、含水量和千粒重試驗，結(jié)果顯示，肉蓯蓉種子的凈度在69.06%～98.99%之間，平均值為90.44%；生活力在23.56%～56.48%之間，平均值為42.01%；含水量在 5.88%～7.21%之間，平均值為6.49%；千粒重在60.36～99.51 mg之間，平均值為83.98 mg。詳見表2。

表2 種子凈度、生活力、含水量和千粒重測定結(jié)果

NO凈度/%千粒重/mg含水量/%生活力/%197.5795.457.2153.38297.4294.066.3951.05398.3595.166.9352.38495.9484.885.9839.87598.9989.316.0042.54688.7587.356.2541.68787.4560.365.9423.56889.2464.455.9427.98989.5062.285.8824.851085.2186.956.5941.461181.4596.656.8449.361287.4286.536.9742.941395.1697.576.9556.481497.8993.166.8652.971597.8495.526.9153.671685.3065.886.0728.481785.9969.496.1430.841887.5067.746.1329.481974.0381.186.6743.002069.0683.486.4645.072173.2584.256.2846.002296.0698.246.8553.752397.4997.716.8952.992496.0399.516.8452.852595.8174.196.9431.042697.0579.116.1533.482796.1676.996.1333.21

2.3 種子檢測指標的相關(guān)性分析

種子的生活力是判定種子質(zhì)量的重要指標，一般來講，生活力高的種子在適宜的條件下一定能出苗，且出苗比較健壯，整齊。本研究以肉蓯蓉種子的生活力為參比，在置信度小于0.01(p<0.01)時，生活力與種子的其他檢測指標表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。詳見表3。

表3 種子質(zhì)量指標相關(guān)性分析

因子 凈度千粒重含水量生活力種子凈度/%1.0000.3250.2000.230種子千粒重/mg0.3251.0000.741**0.969**種子含水量/%0.2000.741**1.0000.768**種子生活力/%0.2300.969**0.768**1.000

注：“**”表示在0.01水平顯著相關(guān)。

種子的含水量與種子的貯藏密切相關(guān)；種子的千粒重可反映種子貯藏物質(zhì)的多少、種子成熟度和幼苗長勢等。從表3可以看出，肉蓯蓉種子的生活力與千粒重相關(guān)性達0.969，生活力與含水量達0.768，千粒重和含水量與生活力的相關(guān)性比較強。凈度與生活力的相關(guān)性相對較弱，為0.230，則凈度對種子質(zhì)量的影響相對較小。所以，本實驗將生活力和千粒重作為肉蓯蓉種子質(zhì)量分級的重要指標，含水量和凈度作為參考指標。

2.4 系統(tǒng)聚類分析

通過對種子4項指標數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2。

經(jīng)系統(tǒng)聚類將27份種子分成了兩大類，其中7、8、9、16、17、18、25、26、27號為一類，為內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)的種子；其余的又劃分為2類，其中4、5、6、10、11、12、19、20、21號為一類，為內(nèi)蒙古其他地區(qū)、甘肅、寧夏等地的種子；剩余的為另一類，為新疆地區(qū)的種子。不同產(chǎn)地種子的指標檢測值有一定差異，表明肉蓯蓉的生長和繁殖容易受到地域的影響。本研究結(jié)合單項指標 K聚類分析結(jié)果，將27份肉蓯蓉種子分為3個等級，其中一級、二級種子為合格種子，質(zhì)量相對較好，三級種子為不合格種子，質(zhì)量相對較差。

2.5 肉蓯蓉種子質(zhì)量檢測指標的K聚類分析

肉蓯蓉種子質(zhì)量檢測指標的K聚類分析結(jié)果見下表，以種子的凈度、千粒重、含水量與生活力為分級指標，以此將肉蓯蓉種子分為3級。分級原則采用最低頂級原則。詳見表4。

表4 種子質(zhì)量指標檢測結(jié)果K聚類分析

類別凈度/%千粒重/mg含水量/%生活力/%194.7493.656.7149.71275.3983.976.5043.88390.4468.946.1529.21

圖2 肉蓯蓉種子4項指標系統(tǒng)聚類樹狀圖

2.6 種子質(zhì)量分級標準的制定

以肉蓯蓉種子凈度、生活力、含水量和千粒重4項指標的平均值作為肉蓯蓉種子分級標準的參考值，結(jié)合生產(chǎn)實際和可操作性，在此基礎(chǔ)上初步制定了肉蓯蓉種子質(zhì)量分級標準，即：一級肉蓯蓉種子外形飽滿，其生活力不低于50.0%，凈度不低于95.0%，水分含量不低于6.8%，千粒重不低于90 mg；二級種子外形較飽滿，其生活力在30.0%～50.0%之間，凈度在85.0%～95.0%之間，水分含量為6.3%～6.8%，千粒重在70～90 mg之間；三級種子有部分癟粒，其生活力不高于30.0%，凈度不低于85.0%，水分含量不高于6.3%，千粒重不高于70 mg。詳見表5。

表5 種子質(zhì)量分級標準

級別生活力/%千粒重/mg凈度/%含水量/%一級≥50.090≥95.0≥6.8二級30.0～50.070～9085.0～95.06.3～6.8三級≤30.070 ≤85.0≤6.3

3 結(jié)論與討論

用于制定肉蓯蓉種子質(zhì)量分級標準的4項檢測指標中，生活力是判斷種子活力的重要依據(jù)，可以反映種子是否具有潛在的發(fā)芽能力[2]。肉蓯蓉作為寄生被子植物，在7月份種子成熟采收后，胚的發(fā)育仍不完全，種子萌發(fā)需要經(jīng)歷后熟及休眠期的過程[3]。有文獻報道，在自然環(huán)境下肉蓯蓉種子要經(jīng)過2個冬季才能完成胚的后熟過程[4]。因此，考慮到肉蓯蓉種子在離體發(fā)芽率測定過程中種子萌發(fā)時間較長，且發(fā)芽率較低，實測發(fā)芽率與種植生產(chǎn)有出入，而不發(fā)芽種子可能也具有潛在的發(fā)芽能力，所以本次研究將生活力作為肉蓯蓉種子質(zhì)量分級的首要指標[5]；千粒重是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的一項指標，已有實驗表明肉蓯蓉種子的形態(tài)指標與千粒重顯著相關(guān)[6]。千粒重可以反映種子中貯藏物質(zhì)的多少和種子的成熟情況，是檢驗種子質(zhì)量和田間預(yù)測產(chǎn)量時的重要依據(jù)。出于可操作性考慮，本次研究忽略粒徑大小對肉蓯蓉種子質(zhì)量的影響，選擇千粒重為肉蓯蓉種子質(zhì)量分級的次要指標；凈度和含水量是種子收購、貯藏的主要參考指標，可以通過清選和干燥來提高質(zhì)量，比較容易受到人為因素或主觀判斷的影響[7]，因此將這2個指標作為肉蓯蓉種子質(zhì)量分級的參考指標。在制定種子質(zhì)量分級標準時，綜合考慮肉蓯蓉種子的生活力、千粒重、凈度以及含水量的檢測結(jié)果，依據(jù)“種子粒徑越大，生活力越高，千粒重越大，凈度越高，種子質(zhì)量越好”的基本原則進行肉蓯蓉種子質(zhì)量分級標準的制定[8]。

本文通過進一步對肉蓯蓉種子各項檢測指標的測定數(shù)據(jù)進行相關(guān)性和聚類分析發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉種子的各項質(zhì)量檢測指標數(shù)據(jù)差異顯著。本次試驗以生活力為主要分級指標，結(jié)合實際生產(chǎn)情況和市場流通情況將肉蓯蓉種子的質(zhì)量初步分為以下3個級別：外形飽滿，生活力為50%及以上的一級肉蓯蓉種子被認定為優(yōu)質(zhì)種子；外形較為飽滿，生活力在30.0%～50.0%之間的二級肉蓯蓉種子被認定為質(zhì)量較好的種子；種子部分有癟粒，生活力低于30.0%的三級種子為品質(zhì)較低或劣質(zhì)種子。該分級標準的制定可作為肉蓯蓉種子檢驗和收購時的參考依據(jù)。

肉蓯蓉人工種植的種子主要來源于野生，種源緊缺且質(zhì)量不穩(wěn)定，價格最高時甚至達到每克120元，成為制約肉蓯蓉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“瓶頸”問題[9]。近年來，隨著各項高產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用及種子繁育基地的建立，需求緊張的現(xiàn)狀有所緩解。肉蓯蓉種子質(zhì)量標準的制定作為中藥材標準化進程的重要組成部分，有利于整合種質(zhì)資源，規(guī)范種質(zhì)資源市場流通及管理，加快肉蓯蓉標準化種植發(fā)展，本標準的實施將產(chǎn)生積極的社會經(jīng)濟效應(yīng)。