巴桑旺堆 孫廣明 洛桑頓珠 劉柳 姜南

摘要：為了解雌性牦牛乳腺中乳脂代謝與轉(zhuǎn)運等現(xiàn)象的分子機理特征。該文提出實驗方法和實驗步驟，利用統(tǒng)計學分析研究方法，對牦牛乳脂合成和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因哺乳期表達規(guī)律進行系統(tǒng)性研究。結(jié)果表明，牦牛的乳脂代謝和轉(zhuǎn)運基因在哺乳期的表達譜與常見奶牛具有較大差異。

關(guān)鍵詞：牦牛;乳脂合成;基因;哺乳期

中圖分類號：S823.2

文獻標識碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.004

0引言

目前，有關(guān)雌性牦牛乳腺功能基因之間、外部因素與控制因素對乳腺功能基因影響等方面的研究仍然相對比較少，因此值得對雌性牦牛乳腺功能基因組實施更加深層次地探索研究。

1材料與方法

1.1材料

選取來自于云南省香格里拉藏族自治州的，5只5歲身體健康雌性牦牛作為本次試驗的試驗樣本。利用較為常見的樣品采集方式，對這5只雌性牦牛產(chǎn)仔前和產(chǎn)仔后的乳腺組織實施樣本收集。

在雌性牦牛乳腺某一側(cè)后方1/5位置收集樣本。在右側(cè)采集20、20、65以及250D的乳腺組織，左側(cè)采集2、35、70以及140D的乳腺組織。在樣本收集的過程中，用專用手術(shù)刀豎向切開2～3°Cm長度的刀口，并隨之將筋膜切開，在傷口部位的兩邊用手施加一定壓力，使乳腺產(chǎn)生外翻現(xiàn)象，然后用手術(shù)剪刀剪取大約1g雌性牦牛乳腺組織。

以單獨性的方式對雌性牦牛樣本采集時間點前后3d的產(chǎn)奶量進行測量，將平均數(shù)值作為該時間點雌性牦牛的產(chǎn)奶量。

1.2RNA提取及DNA、RNA合成

用電子實驗稱稱取150mL左右的雌性牦牛乳腺組織楊蓓，在液態(tài)氮中摻入新型RNA提取劑——TRIZOL試劑，并將其均勻質(zhì)化，移至離心管中。然后，向離心管中摻人三氯甲烷，其中三氯甲烷和TRIZOL試劑的比例應(yīng)為1：5，將二者充分振動，待長達20s振動完成后，將離心管靜置3～5min。

將TRIZOL試劑和三氯甲烷的混合型液體進行長達20min離心，移動上清液到一個新的離心管中。向離心管中摻人異丙醇，異丙醇與TRIZOL試劑的比例約為1：2，將二者混合液靜置10min左右，再進行20min離心[2]。

將管中液體全部倒凈，摻人純度為80%的冷藏乙醇，乙醇和TRIZOL試劑的比例應(yīng)為1：2，離心5min。將液體中的上清液去除，風干沉淀物10～15min。將已經(jīng)獲得的RNA樣本溶解，保存在-90°C環(huán)境中以待使用。隨后利用光度計對RNA樣本進行濃度和純度檢驗，利用電泳方式對RNA完整水平實施準確評估。同時，在實施熒光定量前，將全部RNA樣本濃度全部稀釋至200ng/μL。

最后應(yīng)用PrimeScoriptRTAreagientKittwith cDNAEraser試劑，去掉RNA中的DNA基因組，進而合成cDNA模板。

1.3構(gòu)建標準曲線

利用雌性牦牛的乳腺、腎臟、心臟、肝臟等的cDNA制作標準化曲線模板，對其進行梯度稀釋，利用熒光定量儀器制作標準化曲線。每一個試管中的混合液體均為2μLcDNA、6μL預(yù)混液。在構(gòu)建標準化曲線的過程中，每份樣本重復3次對照性試驗。利用熒光定量相關(guān)軟件對熒光定量信息數(shù)據(jù)實施系統(tǒng)性分析，構(gòu)建標準化曲線[3]。

1.4統(tǒng)計分析

將線粒體核糖體蛋白L39、B型細胞骨架肌動蛋白、ITGB4BP多克隆抗體作為內(nèi)參基因，利用熒光定量軟件對采集到的信息數(shù)據(jù)實施處理，獲取標準化以后的目的基因標準差異和表達數(shù)值。隨之將每種基因的5d表達數(shù)值記為“1”，其與時間點的表達數(shù)值全部除5，作為后續(xù)統(tǒng)計工作的基本單位。

利用SAS9.2.1版本統(tǒng)計軟件（STATISTICALANALYSISSYSTEM）對重復測量信息實施統(tǒng)計分析，將其作為評估目的基因在雌性牦牛哺乳期中表達時間效應(yīng)。在混合型模型中，應(yīng)用最大似然估計（ML）實施系統(tǒng)性估計，選用符合對稱作為協(xié)方差的基本結(jié)構(gòu)。同時，在該模型中，將各個時間點作為固定效應(yīng)，不同的雌性牦牛當做隨機效應(yīng)，在事后檢驗中（post-hoctest）使用t-檢驗對差異性時間點之間的顯著性實施檢驗。此外，基因的方式表達值與整體RNA濃度與產(chǎn)奶總量之間相關(guān)系數(shù)應(yīng)用SAS9.2.1軟件計算。

2結(jié)果

2.1RNA純度和完整性分析

利用紫外分光光度設(shè)備，對試驗中提取的RNA樣本實施測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部樣品OD280值均為1.85～2.15。利用瓊脂糖凝膠電泳（Agarosegel）對RNA完整性進行鑒定，其18S和28S條帶清晰度較高且明顯可見，無降解現(xiàn)象發(fā)生。因此試驗中提取的RNA樣本與熒光定量PCR要求符合度較高[4]。

2.2目的基因表達變化與統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果

對目的基因均改變倍數(shù)實施統(tǒng)計檢驗發(fā)現(xiàn)，在雌性牦牛哺乳期間，基因表達程度呈極顯著性差異（P<0.01）。和15d相比，30d與60d的表達程度呈極顯著性差異（P<0.01）和顯著性差異（P<0.05）。而將30d與60d的表達數(shù)據(jù)對比，表達程度無明顯差異（P<0.05）。對整體RNA實施統(tǒng)計檢驗發(fā)現(xiàn)，在雌性牦牛哺乳期間，和15d比較，在30d、60d和120d的時間點的整體RNA濃度發(fā)生明顯差異（P<0.05），而此3個時間點間對比，濃度無明顯差異（P<0.05）。對產(chǎn)奶總量實施統(tǒng)計檢驗我們發(fā)現(xiàn)，在雌性牦牛哺乳期力，具體產(chǎn)奶數(shù)量的改變呈現(xiàn)出極顯著性的差異（P<0.01）。對所有目的基因均表達變化、整體RNA濃度以及產(chǎn)奶量間進行皮爾森相關(guān)性分析（Pearson correlation coefficient）發(fā)現(xiàn)整體RNA濃度和產(chǎn)奶量之間展現(xiàn)出正相關(guān)（r=0.762，P=0.151）;目的基因表達和產(chǎn)奶量明顯低度，正相關(guān)（r-0.278、P=0.651），而與整體RNA濃度展現(xiàn)出顯著性高度正相關(guān)（1=0.853、P=0.021）。

3結(jié)論

除DGAT2表達水平在達到峰值以前出現(xiàn)相對緩慢提高、隨后出現(xiàn)快速下降外，別的基因表達水平在達到峰值前，均展現(xiàn)急速上升狀態(tài)，隨后出現(xiàn)緩慢下降情況，但總趨勢在雌性牦牛進入哺乳期后，表達水平均出現(xiàn)顯著提升。

因為牦牛自身具有特異性，同時在哺乳期，雌性牦?；虮磉_水平與共調(diào)控關(guān)系等和相對常見、知名度較高的奶牛品種存在較大差異。

參考文獻

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