張丹 殷茵 戈成 趙子墨 李富強(qiáng) 崔茂盛

摘要：該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)天津市部分地區(qū)種公豬常溫精液的抽樣調(diào)查，分別對(duì)所采樣品進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，最終利用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)菌分離鑒定。該次試驗(yàn)共檢測(cè)出3種細(xì)菌，分別是埃希氏菌屬大腸桿菌、腸道球菌屬糞鏈球菌及粘質(zhì)沙雷菌。

關(guān)鍵詞：常溫種公豬精液;細(xì)菌培養(yǎng);分離鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.003

0引言

豬的人工授精技術(shù)在我國(guó)于20世紀(jì)60-70年代已廣泛開(kāi)展，經(jīng)過(guò)不斷研究，目前此項(xiàng)技術(shù)已較為完善，大幅度提高優(yōu)秀種公豬的利用率，并且在一定程度上減少了疫病傳播。但是常溫保存下的種公豬精液很容易滋生細(xì)菌等微生物，這些微生物很有可能導(dǎo)致精液質(zhì)量下降，直接影響母豬受胎率[1]。因此種公豬常溫精液中細(xì)菌的分離鑒定對(duì)精液的保存及利用也是至關(guān)重要的。

1試驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1儀器

恒溫培養(yǎng)箱（品牌：博訊;型號(hào)：GSP-9050MBE）;生物安全柜（品牌：力康;型號(hào)：Hfsafe-1500A2）;生物顯微鏡（品牌：奧林帕斯;型號(hào)：BX43）;高壓滅菌器（品牌：博訊;型號(hào)：YXQ-0LS-50SII）;醫(yī)用常溫冰箱（品牌：海爾;型號(hào)：HY°C-260）;全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀（品牌：BiomerieuxsaFrance;型號(hào)：VITEK2 compact）

1.2材料

培養(yǎng)基（普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基）;革蘭氏陰性菌鑒定卡;革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定卡;營(yíng)養(yǎng)肉湯;革蘭氏染色套裝;酒精燈;接種環(huán)等。

2試驗(yàn)步驟

2.1樣品準(zhǔn)備

（1）分4次共抽取不同種公豬、不同時(shí)間的100份種公豬常溫精液作為樣品，每次獲得樣品數(shù)量25份。

（2）將抽取的樣品保存在精液保存箱中，在精液管上標(biāo)注好采樣時(shí)間及所取種公豬的耳標(biāo)號(hào)。

2.2細(xì)菌培養(yǎng)及提純

（1）每次試驗(yàn)在25份樣品中隨機(jī)抽取5份種公豬常溫精液，搖勻，取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂10個(gè)（每個(gè)樣品接種2個(gè)），用無(wú)菌接種環(huán)挑取精液樣本，均勻涂抹在培養(yǎng)基上;蓋好皿蓋，標(biāo)記好接種時(shí)間，所取樣品的耳標(biāo)號(hào)（每個(gè)耳標(biāo)號(hào)接種2份）;然后將普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板倒置放入37°C的細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h。見(jiàn)圖1、圖2。

（2）24～48h后，從原始的培養(yǎng)皿中依次挑取一半的單一菌落，依次在瓊脂培養(yǎng)基平板中劃線(xiàn)接種。然后將平皿蓋蓋好，用高壓過(guò)的記號(hào)筆寫(xiě)下接種時(shí)間、菌種來(lái)源，倒置放人恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照此方法操作，直到將樣品接種培養(yǎng)基上的所有菌落分離，得到單一純化菌種。見(jiàn)圖3、圖4。

（3）將選取待檢菌落，同時(shí)挑取剩下半個(gè)單一檢菌落接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18～24h。在肉湯管上，標(biāo)記好接種時(shí)間、菌種來(lái)源，以備待用。

（4）采用革蘭氏染色方法，對(duì)分離到的微生物菌落進(jìn)行涂片染色，觀察菌體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，判斷其陰陽(yáng)性。

（5）利用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀對(duì)待檢細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

2.3細(xì)菌鑒定

利用自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，得到鑒定結(jié)果。

2.4常溫精液鑒定

其余95份常溫精液樣品，依照2.2、2.3步驟進(jìn)行鑒定。

3結(jié)果與分析

本次試驗(yàn)共檢測(cè)出3種細(xì)菌，按照細(xì)菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)、染色后的鏡檢結(jié)果，以及微生物分析系統(tǒng)的鑒定報(bào)告，現(xiàn)已確定分離出的細(xì)菌種類(lèi)為3種，分別是埃希氏菌屬大腸桿菌、腸道球菌屬糞鏈球菌及粘質(zhì)沙雷菌。其中大腸桿菌和糞鏈球菌均為腸道內(nèi)常駐菌，而粘質(zhì)沙雷菌可存在于尿道中。見(jiàn)圖5。

4討論與結(jié)論

豬精液中微生物有動(dòng)物性和非動(dòng)物性2種來(lái)源，第1種主要是由于公豬發(fā)生疾病，病原微生物是病毒感染生殖道或其他組織所致。第2種污染來(lái)源主要來(lái)自于收集精液，即采精過(guò)程，精液暴露于環(huán)境中受環(huán)境微生物侵染[2]。本次所檢測(cè)的對(duì)象來(lái)源均為正規(guī)種公豬場(chǎng)，皆有嚴(yán)格的疫苗接種及疫病監(jiān)護(hù)手段，同時(shí)從檢測(cè)結(jié)果分析，所檢出的3種細(xì)菌所占比例均不超過(guò)10%，故可暫且不考慮動(dòng)物自身帶有疾病的可能，當(dāng)然若需明確排除，還要進(jìn)一步輔助檢測(cè)手段。

市場(chǎng)上銷(xiāo)售的稀釋劑中普遍添加有抑菌效果的抗生素類(lèi)藥物，比較常見(jiàn)的有氨基糖甙類(lèi)、林可酰胺類(lèi)和乳胺類(lèi)抗生素[3]，所以稀釋后的常溫種公豬精液應(yīng)該是無(wú)菌的，但從檢測(cè)出大腸桿菌的結(jié)果進(jìn)行分析，在實(shí)際使用中依然存在微生物在稀釋精液中大量存在，并且生長(zhǎng)繁殖生命活動(dòng)可以正常進(jìn)行，或者在短時(shí)間可以達(dá)到抑菌作用，但保存時(shí)間達(dá)到2～3d后微生物抑制效果就已衰弱的現(xiàn)象，究其原因可能是添加的抗生素類(lèi)藥物對(duì)感染精液的微生物不敏感。因此，應(yīng)定期對(duì)常溫種公豬精液進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出抑菌效果好的抗生素。

檢測(cè)出糞鏈球菌的樣品中均為檢測(cè)出大腸桿菌這一試驗(yàn)結(jié)果，可推測(cè)出糞鏈球菌可能具有抑制大腸桿菌的作用;而粘質(zhì)沙雷氏菌的檢出，不排除采集精液時(shí)有尿液混人的可能，因此建議應(yīng)嚴(yán)格控制采精流程，提高采精人員的技術(shù)水平，以免精液在采集過(guò)程中受到污染。

參考文獻(xiàn)

[1]張家慶，伏彭輝，毛獻(xiàn)寶，等.公豬精液中細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)豬，2009（6）：55-56.

[2]金穗華，劉源遠(yuǎn)，許國(guó)林，等.公豬精液中細(xì)菌種類(lèi)及藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)豬，1994（1）：19-20.

[3]孫曉軍，滾雙寶、豬精液常溫保存稀釋液篩選試驗(yàn)[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2010，40（4）：13-15.