梁瓊 向旺 鄒佳 何玲 袁莉瑤 劉平安 張國民

〔摘要〕 目的 探究壯骨止痛膠囊含藥血清調控成骨相關轉錄因子抗體（osterix， OSX）、骨橋蛋白（osteopontin， OPN）對去勢大鼠成骨細胞分化的機制。方法 50只3月齡雌性大鼠，隨機分為空白組、假手術組、模型組、骨松寶組和壯骨止痛膠囊組，10只/組，除空白組及假手術組外，摘除雙側完整卵巢，然后各組分別予以相應干預，獲取相應血清;10只新生SD乳鼠提取原代成骨細胞，培養(yǎng)至第三代后添加上述分組相應10%血清，銀染及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）染色鑒定成骨細胞，免疫組化檢測OSX、OPN蛋白的表達。結果 各組中的成骨細胞銀染呈褐色、堿性磷酸酶染色呈藍紫色;免疫組化結果表明，骨松寶組、壯骨止痛膠囊組中細胞質呈棕色;空白組和假手術組呈淺棕黃色;模型組幾乎不見棕黃色。與假手術組比，模型組OSX、OPN蛋白的表達率降低（P<0.05）;壯骨止痛方及骨松寶干預后OSX、OPN蛋白表達率較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 壯骨止痛膠囊組含藥血清能促進OSX、OPN蛋白分泌，從而促進成骨細胞增殖、分化，發(fā)揮抗絕經后骨質疏松作用。

〔關鍵詞〕 壯骨止痛膠囊;骨質疏松癥;含藥血清;成骨相關轉錄因子抗體;骨橋蛋白

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.006

Effect of Zhuanggu Zhitong Capsule on Osteoblast Differentiation in Ovariectomized Rats by Regulating Osterix and Osteopontin

LIANG Qiong1， XIANG Wang1， ZOU Jia1， HE Ling2， YUAN Liyao1， LIU Pingan1*， ZHANG Guomin1*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421001， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Zhuanggu Zhitong Capsule-containing serum on osteoblast differentiation in ovariectomized rats by regulating osterix （OSX） and osteopontin （OPN）. Methods Fifty three-month-old female rats were equally and randomly divided into blank group， sham-operation group， model group， Gusongbao group， and Zhuanggu Zhitong Capsule group. Both intact ovaries were taken for all rats except those in the blank group and the sham-operation group. And then each group was given the corresponding intervention to collect their serum. Ten neonatal Sprague-Dawley mice were used to isolate primary osteoblasts. When the primary osteoblasts were cultured to the third generation， the 10% serum from the above groups was added. Silver staining and alkaline phosphatase （ALP） staining were used to identify osteoblasts， and immunohistochemistry was used to determine the expression of OSX and OPN. Results The osteoblasts in each group were brown in silver staining assay and blue-violet in ALP staining assay. The immunohistochemical results showed that the cytoplasm was brown in the Gusongbao group and the Zhuanggu Zhitong Capsule group; the cytoplasm was light brownish yellow in the blank group and the sham-operation group; no brownish yellow was observed in the model group. Compared with the sham-operation group， the model group had significantly lower expression rates of OSX and OPN （P<0.05）. The Zhuanggu Zhitong Capsule group and the Gusongbao group had significantly higher expression rates of OSX and OPN than the model group （P<0.05）. Conclusion The Zhuanggu Zhitong Capsule-containing serum can promote the secretion of OSX and OPN to promote the proliferation and differentiation of osteoblasts， thus exerting anti-menopausal osteoporosis.

〔Keywords〕? Zhuanggu Zhitong Capsule; osteoporosis; serum drug containing; osterix; osteopontin

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis， POP）指由絕經引起的骨質疏松癥（osteoporosis，OP），亦稱Ⅰ型骨質疏松癥[1]。POP是以單位體積內骨量絕對減少、骨組織顯微結構退化、骨密度降低及骨強度減弱為特征，以致骨脆性增高及骨折危險性增加的一種全身代謝性骨病，嚴重威脅絕經后婦女的身體健康和生活質量[2]。POP主要發(fā)病原因為體內雌激素水平的降低，用雌激素替代療法療效顯著，但長期使用雌激素存在副反應及停藥后反跳現(xiàn)象[3]。目前研究認為Hedgehog信號通路可以通過上調下游靶基因成骨相關轉錄因子抗體（osterix，OSX）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）來促進成骨細胞增殖、分化，進而抗骨質疏松癥[4]。本實驗采用國內外公認的雌性大鼠去卵巢制備絕經后骨質疏松癥病理模型，術后連續(xù)給藥13周，提取含藥血清100 mL。于新生SD乳鼠顱骨中提取原代成骨細胞，通過雌性大鼠去卵巢造模后制備含藥血清干預調控新生SD乳鼠成骨細胞增殖分化，結合成骨細胞一般形態(tài)學、免疫組化染色及OSX、OPN蛋白的表達率等指標觀察檢測結果，初步探討壯骨止痛膠囊治療骨質疏松癥的療效及可能機制。

1 材料

1.1? 動物

3月齡雌性SPF級SD大鼠50只，體質量（200±10）g;24 h內新生SD乳鼠10只，許可證號：SCXK（湘）2013-0004;均由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2? 藥物制備

壯骨止痛膠囊（購自四川美大康藥業(yè)有限責任公司，批號：201709113）;骨松寶顆粒（購自貴州富華藥業(yè)有限責任公司，批號：201711125）。藥物用蒸餾水溶解后灌胃，2 mL/次，1次/d，藥物于-20 ℃冷藏備用。

1.3? 試劑

1%戊巴比妥鈉;DMEM低糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、抗青霉素抗體、抗鏈霉素抗體均由上海立菲生物科技公司提供，胎牛血清由浙江天杭生物科技有限公司提供;硝酸銀溶液由progema生物科技公司提供;堿性磷酸酶染色試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、OSX、OPN一抗試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司。

1.4? 儀器

RKI-100-BC0超凈工作臺（北京實驗儀器廠）、2培養(yǎng)箱（日本池本理化工業(yè)株式會社）、OlympusCK40倒置相差顯微鏡（奧林巴斯有限公司）、JY3002電子天平（上海精密科學儀器有限公司）、超低溫冰箱（美國REVCO公司）、LEICA DM LB2雙目顯微鏡（德國LEICA公司）、MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（北航公司）、Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司）。

2 方法

2.1? 動物分組及造模

50只3月齡SD雌性大鼠，按隨機數(shù)字表方法隨機分為5組，分別為空白組、假手術組、模型組、骨松寶組、壯骨止痛膠囊組，每組10只，稱質量并記錄。造模方法：用1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/100 g）腹腔內注射麻醉后，將模型組、骨松寶組、壯骨止痛膠囊組摘除大鼠雙側完整卵巢;假手術組僅切除卵巢周圍相應體積的脂肪組織，空白組不做任何處理。

2.2? 含藥血清的制備

按人-大鼠體表面積比值換算成人臨床等效給藥劑量，壯骨止痛膠囊：給藥劑量為0.486 g/（kg·d），200 g的大鼠每只灌胃2 mL;骨松寶顆粒：給藥劑量1.35 g/（kg·d），200 g大鼠每只灌胃2 mL;其他組給予相同體積的生理鹽水;藥物劑量每周按體質量校正1次。各組動物造模術后開始干預連續(xù)13周，1次/d，末次給藥1 h后，腹主動脈取血2 mL/只;所取血液以3 000 r/min速度離心，取上層血清，56 ℃水浴滅活30 min，經0.22 μm一次性濾膜抽濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3? 成骨細胞的分離和培養(yǎng)

24 h內新生SD乳鼠，放入75%的乙醇浸泡2 min，取其顱骨，刮除顱骨周圍的結締組織，用眼科剪將骨組織剪碎至1 mm×1 mm，0.25%胰酶37 ℃水浴30 min（中間振蕩1次），1 000 r/min速度離心10 min，將骨片移入0.1%Ⅱ型膠原酶中，37 ℃水浴60 min（中間振蕩1次）;再以1 000 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入適量DMEM培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶;于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換1次液，待細胞貼壁接近90%，用0.25%胰酶消化，從一個培養(yǎng)瓶以1∶2轉移到另外2個培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，直至第3代[5]。

2.4? 含藥血清的添加

將培養(yǎng)至第三代的成骨細胞，經0.25%胰酶2 mL消化，以800 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入適量DMEM培養(yǎng)基，制成細胞懸液;用細胞計數(shù)板將其調整為5×105/mL的濃度，接種至24孔板培養(yǎng)，24 h細胞貼壁后換成10%的含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組12孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后備用。

2.5? 細胞鑒定

2.5.1? 成骨細胞一般形態(tài)學觀察? 將“2.3”細胞培養(yǎng)瓶放于倒置顯微鏡鏡下觀察，確定成骨細胞的形態(tài)及生長方式，拍照并記錄[6]。

2.5.2? 銀染? 取“2.3”細胞培養(yǎng)瓶中細胞在1%硝酸銀溶液及紫外線照射下染色30 min，蒸餾水反復漂洗后用5%硫代硫酸鈉還原，再用1%中性紅復染;鏡下觀察成骨細胞是否有鈣化結節(jié)的形成[6]。

2.5.3? 堿性磷酸酶染色? 取第3代細胞，6×103/L細胞濃度接種于24孔板上，細胞貼壁后開始試驗，培養(yǎng)第7天棄培養(yǎng)液，按堿性磷酸酶試劑盒說明書進行偶氮偶聯(lián)法對成骨細胞進行染色，測定其堿性磷酸酶活性。

2.6? 免疫組化法檢測OSX和OPN蛋白

將添加了含藥血清的成骨細胞按通用型SABC試劑盒說明書操作，分別滴加OSX和OPN一抗抗體，37 ℃ 80 min，PBS沖洗3次，每次2 min;添加二抗，37 ℃ 20 min，PBS沖洗3次，每次2 min;滴加SABC，37 ℃ 20 min，PBS沖洗4次，每次5 min;添加DAB顯色劑，顯色后染成棕黃色為陽性結果。200倍光鏡下用顯微攝像系統(tǒng)隨機選取5個不同視野，通過圖像分析系統(tǒng)，選取陽性面積來評估陽性表達細胞面積占總細胞面積的百分比，最后取五個視野的平均值，即為OSX和OPN蛋白的陽性表達率。

2.7? 統(tǒng)計學分析

用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析袁實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，如方差齊，組間差異采用單因素方差分析;如方差不齊，用秩和檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 成骨細胞的鑒定

3.1.1? 成骨細胞的一般形態(tài)學觀察? 倒置顯微鏡下觀察，細胞貼壁生長，呈梭形、有突起，單核呈卵圓形。生長狀態(tài)好的細胞，由于細胞間相互促進作用，可呈鋪路石狀，形成不透光礦化結節(jié)。尚未傳代細胞可見細胞從骨片爬出現(xiàn)象，而傳代細胞多為梭形，較透亮。見圖1。

3.1.2? 銀染? 鏡下見細胞聚集，大量鈣化結節(jié)形成，結節(jié)中央呈黑色，周邊呈褐色，周圍顏色逐漸變淡。見圖2。

3.1.3? 堿性磷酸酶染色? 堿性磷酸酶染色鏡下見細胞質染成藍色，細胞核染成綠色，細胞呈陽性反應。見圖3。

3.2? 免疫組化

3.2.1? OSX蛋白表達? 成骨細胞中蛋白的陽性表達，即為細胞膜和胞漿被染成棕黃色。模型組較空白組和假手術組的陽性細胞表達減少，而壯骨止痛膠囊組和骨松寶組較模型組明顯增加，見圖4。

3.2.2? OPN蛋白表達? 成骨細胞中蛋白的陽性表達，即為細胞膜和胞漿被染成棕黃色，模型組較空白組和假手術組的陽性細胞表達減少，而壯骨止痛膠囊組和骨松寶組較模型組明顯增加，見圖5。

3.2.3? OSX、OPN蛋白表達率? 與空白組比較，假手術組大鼠血清OSX、OPN蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），模型組大鼠血清OSX、OPN蛋白陽性表達率下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，骨松寶組和壯骨止痛膠囊組大鼠血清OSX、OPN蛋白陽性表達率均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1。

4 討論

骨質疏松癥的字義是“多孔的骨頭”，是一種鈣質由骨骼往血液凈移動造成礦物質的流失，骨質量減少，骨骼內孔隙增大，呈現(xiàn)中空疏松的現(xiàn)象。絕經后骨質疏松癥主要是由于體內雌激素下降，成骨細胞上相應雌激素受體減少，從而導致骨吸收明顯加快，骨礦物質含量丟失的同時，也會出現(xiàn)骨小梁的退行性病變，即骨小梁變細、穿孔或消失，骨小梁數(shù)目減少，骨體積下降[7]。OP是多因素介導的復雜疾病，其流行病學研究表明老年婦女骨質疏松患病率相對較高，年齡、絕經年齡及體質量指數(shù)（body mass index， BMI）等是OP患病率的主要影響因素[8]。絕經后骨質疏松主要見于絕經后婦女，隨著我國人口老齡化的進程，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，研究絕經后骨質疏松癥的防治和治療顯得尤其重要。

研究表明[9]Hedgehog信號通路參與了間充質干細胞的增殖分化、軟骨細胞形成、成骨細胞形成及軟骨骨化等一系列過程，此通路涉及RUNT相關的轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、OSX、OPN、Smads等轉錄因子;此外，Hedgehog通路可以通過上調Runx2來上調OSX、OPN的表達[10]。Runx2屬于Runt結構域轉錄因子家族，是骨發(fā)育過程中骨髓基質干細胞向成骨細胞分化和成骨細胞成熟的重要轉錄和調控因子，Runx2過表達在成骨早起能促進成骨細胞分化，但在成骨晚期可能抑制成骨細胞的分化。在動脈粥樣硬化的形成過程中，可能與血管平滑肌細胞表達Runx2的增加，使血管內皮細胞分化為成骨細胞從而導致血管的鈣化有關[11]。OSX是一種具有鋅指基序結構域的可促進成骨細胞增殖、分化的特異性轉錄因子，且為成骨前體細胞進一步分化為成熟的成骨細胞的作用靶點。OSX過表達后能增強ALP活性，提高成骨基因;若OSX表達缺失，細胞則向軟骨細胞分化。另一方面，OSX位于Runx2的下游，避免了Runx2抑制成骨細胞的晚期分化的問題[12]。通過研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎時期骨骺生長板中的成骨細胞存在OPN的表達[13]。成骨細胞可以分泌OPN，在骨基質的礦化過程中有重要作用。OPN分子中有富含天冬氨酸的區(qū)域，通過這區(qū)域OPN可以與組織中的輕磷灰石結合而發(fā)揮作用[14]，組建骨礦質，在骨骼內含量豐富并且參與骨折愈合過程。因此通過上調OSX、OPN蛋白的表達，對成骨細胞增殖分化、軟骨細胞成熟、骨基質蛋白的產生以及骨發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用，對防治骨質疏松癥意義重大。

壯骨止痛方是湖南省中醫(yī)藥大學莫新民教授經驗方，已獲得國家新藥證書（國藥準字Z20050125），此方是在古方補骨脂丸的基礎上結合臨床用藥經驗研制而成，由補骨脂、淫羊藿、枸杞、骨碎補、丹參等組成，具有補益肝腎、壯骨止痛之功，經過長期的臨床應用，已證實其對骨質疏松癥有良好的療效[15]，但具體作用機制尚不清楚。本研究通過雌性大鼠去卵巢造模后制備含藥血清干預調控新生SD乳鼠成骨細胞增殖分化，對成骨細胞進行原代培養(yǎng)后通過細胞形態(tài)學觀察、細胞銀染、堿性磷酸酶染色，確定了培養(yǎng)的細胞為成骨細胞。再進行免疫組化染色觀察、成骨細胞OSX、OPN蛋白的表達率等檢測，與模型組相比，假手術組和空白組OSX、OPN蛋白的表達率升高，壯骨止痛方及骨松寶干預后OSX、OPN蛋白表達率較模型組顯著升高。依據(jù)本研究結果分析可得，壯骨止痛膠囊抗骨質疏松的作用可能與上調OSX、OPN蛋白促進成骨細胞的增殖、分化，從而促進骨形成、抑制骨吸收，使得骨量增加有關。

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