閆林 黃麗芳 王曉陽 孫燕 林興軍 董云萍 龍宇宙

摘要：【目的】對我國收集保存的咖啡種質資源進行遺傳多樣性分析，為咖啡種質資源的收集、保存、鑒定、創(chuàng)新及有效利用提供理論參考。【方法】從哥倫比亞大學（UBC Primer Set #9）公布的100個ISSR引物序列中篩選出多態(tài)性好、擴增條帶清晰且重復性好的引物，利用其對72份咖啡種質材料進行擴增，對電泳圖譜進行統(tǒng)計分析，并利用NTSYSpc 2.1計算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。根據(jù)非加權算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，并進行主坐標分析。【結果】篩選出的19條引物共擴增出153條條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為128條，占總條帶數(shù)的83.7%;72份咖啡種質材料間的遺傳相似系數(shù)為0.4531～0.9609，平均為0.6567;遺傳距離為0.0351～1.0951，平均為0.4081。其中，大粒種種內遺傳相似系數(shù)最大（0.9297～0.9531），遺傳距離最?。?.0445～0.0669）;中粒種種內遺傳相似系數(shù)最小（0.5781～0.8750），遺傳距離最大（0.1210～0.5363）。主坐標分析與聚類分析結果一致，均顯示72份咖啡種質材料可分為三大類，其中3份大粒種、3份查理種及1份中粒種巴布亞新幾內亞-2聚為Ⅰ類群;32份小粒種聚為聚為Ⅱ類群;除巴布亞新幾內亞-2外的其他31份中粒種及1份中小粒雜交種Arabusta和1份福建咖啡共33份聚為Ⅲ類群。聚類分析結果與種質地理來源無明顯相關性?！窘Y論】咖啡種質資源各種間存在較大的遺傳差異，以中粒種種內遺傳多樣性較豐富，以大粒種種內遺傳多樣性較低。利用ISSR分子標記可準確分析咖啡資源遺傳多樣性。

關鍵詞： 咖啡;ISSR;遺傳多樣性;聚類分析;主坐標分析

中圖分類號： S571.202.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0491-09

0 引言

【研究意義】咖啡（Coffea spp.）主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，約有124種（Davis et al.，2006;Ceja-Navarro et al.，2015）。商業(yè)栽培主要有小粒種咖啡（C. arabica Linné）和中粒種咖啡（C. canephora Pierre）。小粒種咖啡為四倍體物種（2n=4x=44），由中粒種咖啡和C. eugenoedes或其他生態(tài)型相近的二倍體自然雜交而成（Anthony et al.，2002;Silvestrini et al.，2007;Cenci et al.，2012）。除小粒種咖啡外，其余咖啡屬物種均為二倍體（Stoffelen et al.，2009;Nowak et al.，2011）。我國云南和海南等省收集保存了大量咖啡種質資源，并對其進行鑒定評價，但主要集中于形態(tài)學和抗銹性鑒定評價研究（周華等，2015;武瑞瑞等，2017），不利于后續(xù)的資源創(chuàng)新利用和優(yōu)良品種選育研究。利用分子標記技術對咖啡種質資源進行鑒定評價，明確其親緣關系，對咖啡種質資源利用和優(yōu)良品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】ISSR分子標記兼具RAPD和SSR分子標記的優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應用于生物的品種鑒定（Culley and Wolfe，2001）、遺傳圖譜構建（易克等，2003）、遺傳多樣性分析（朱巖芳等，2010;張盾等，2018）、基因定位（李冬梅，2016）等研究方面，其中在咖啡種質資源遺傳多樣性評價方面也有廣泛應用（Masumbuko and Bryngelsson，2006;Kassahun et al.，2014）。利用ISSR分子標記不僅可評價小粒種咖啡種內的遺傳差異，還能有效揭示來自剛果基因庫的中粒種咖啡存在遺傳變異（Masumbuko and Bryngelsson，2006;Tshilenge et al.，2009）。Ruas等（2003）研究表明不同產(chǎn)地的8種咖啡的遺傳多樣性豐富，遺傳相似系數(shù)為0.25～0.86。Aga等（2005）利用11個為ISSR分子標記分析來自埃塞俄比亞4個地區(qū)的咖啡種質遺傳變異，結果表明不同地區(qū)群體間遺傳差異較同一地區(qū)群體內遺傳差異大。Kumar等（2008）利用RAPD和ISSR分子標記分析咖啡屬與光花咖啡屬間的基因組相似性，結果表明二者存在明顯差異，且基因組相似性與地理分布存在緊密的關聯(lián)性。Kassahun等（2014）利用9個ISSR引物分析埃塞俄比亞125份咖啡野生種和地方品種的遺傳結構，結果表明，地方品種起源于埃塞俄比亞的不同地理區(qū)域，且以Yayu和Bonga群體遺傳多樣性最高，其次是Berhane Kontir群體。Motta等（2014）應用SSR和ISSR分子標記分析10個小粒種和7個中粒種咖啡的基因型特征，結果表明在種間和種內均存在明顯的基因型差異。黃麗芳等（2014，2017）利用RAPD分子標記分析我國咖啡種質資源的遺傳多樣性和親緣關系，結果表明種間和種內均存在明顯的遺傳差異，遺傳多樣性豐富。【本研究切入點】目前，鮮見有關利用ISSR分子標記對我國咖啡種質資源進行遺傳多樣性分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用ISSR分子標記對我國收集保存的72份咖啡種質資源進行遺傳多樣性分析，為咖啡種質資源的分類鑒定、有效利用及新品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

72份供試咖啡種質資源基本信息見表1，其中中粒種（C. canephora Pierre）資源32份（編號7～35、58、66、67），小粒種（C. arabica. Linné）資源32份（編號36～57、60～65、69～72），查理種（C. excelsa Chevalier）資源3份（編號4～6），大粒種（C. liberica Bull ex Hiern）資源3份（編號1～3），中小粒雜交種（C. canephora Pierre×C. arabica Linné）1份（編號59），來自福建的分類不明確資源1份（編號68，下文簡稱福建咖啡）。編號1～67由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所提供，編號68～72采自海南省澄邁縣農(nóng)戶種植基地。ISSR引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、10×PCR Buffer和DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：PCR擴增儀（Bio-Rad，美國）、冷凍離心機（Hettich，德國）、超微量分光光度計（Nanodrop，美國）和全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，中國）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采摘健康植株上的無病蟲害成熟葉片，液氮速凍后-80 ℃保存。利用CTAB改良法提取葉片總DNA（黃麗芳等，2011），并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量、微量分光光度計檢測其濃度，用ddH2O稀釋至20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 ISSR-PCR擴增 參照閆林等（2012）的方法建立最佳ISSR-PCR反應體系及擴增程序。反應體系20.00 μL：10×PCR Buffer 2.00 μL，5 ng/μL DNA模板4.00 μL，10 mmol/L dNTPs 0.60 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，25 mmol/L MgCl2 1.20 μL，10 μmol/L引物1.20 μL，ddH2O補足至20.00 μL。ISSR擴增程序：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 15 s，35～50 ℃ 1 min，72 ℃ 78 s，進行40個循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。

1. 2. 3 引物篩選 按照優(yōu)化后的最佳ISSR-PCR反應體系及擴增程序，以4份遺傳背景差異較大的咖啡種質（27號、臺灣小粒種、大粒種1和M10）基因組DNA為模板，利用哥倫比亞大學（UBC Primer Set #9）公布的100個ISSR引物，從中篩選出多態(tài)性好且擴增條帶清晰的引物用于后續(xù)咖啡種質資源遺傳多樣性分析。

1. 3 統(tǒng)計分析

根據(jù)擴增條帶在瓊脂糖凝膠中遷移率的不同，統(tǒng)計每個樣品的擴增電泳譜帶。在同一遷移位置上，有條帶賦值“1”，無條帶賦值“0”。采用NTSYSpc 2.1計算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，根據(jù)非加權算術平均法進行聚類分析，最后基于遺傳相似系數(shù)進行主坐標分析。

2 結果與分析

2. 1 多態(tài)性分析結果

從哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物中篩選出19條擴增條帶清晰、重復性高的引物，部分引物的PCR擴增結果。利用其對72份咖啡種質資源進行ISSR多態(tài)性分析，結果（表2）顯示，共擴增出153條條帶，大小為170～2100 bp，不同引物的擴增帶數(shù)為3～14條，平均每條引物擴增8.0條條帶，其中多態(tài)性條帶128條，占總條帶數(shù)的83.7%。

2. 2 遺傳相似系數(shù)分析結果

應用NTSYSpc 2.1計算咖啡種質材料間的遺傳相似系數(shù)，得到相似性矩陣。72份咖啡種質材料間的遺傳相似系數(shù)為0.4531～0.9609，平均為0.6567。由表3可知，所有種質間均有不同程度的遺傳差異，其中綠頂M11與福建咖啡品種遺傳相似系數(shù)最小，為0.4531，表明二者遺傳差異最大;CTM3（CIFC7962）與CTM19遺傳相似系數(shù)最大，為0.9609，遺傳差異最小，二者在形態(tài)上較相近。

不同的種內遺傳相似系數(shù)差異也較大。中粒種種內遺傳相似系數(shù)為0.5781～0.8750，平均為0.7250;小粒種種內遺傳相似系數(shù)為0.5234～0.9609，平均為0.7961;大粒種種內遺傳相似系數(shù)為0.9297～0.9531，平均為0.9427;查理種種內遺傳相似系數(shù)為0.7188～0.8672，平均為0.7813。可見，中粒種遺傳多樣性較豐富，大粒種遺傳多樣性較低。

2. 3 遺傳距離分析結果

應用NTSYSpc 2.1計算咖啡種質材料間的遺傳距離。由表4可知，72份咖啡種質材料的遺傳距離為0.0351～1.0951，平均為0.4081。其中，CTM3（CIFC7962）與CTM19的遺傳距離最小，為0.0351，興2與CTM19遺傳距離為0.0413，南頂與石壟坡遺傳距離為0.0445，表明二者間遺傳差異較小;綠頂M11與福建咖啡遺傳距離最大，為1.0951，表明二者間遺傳差異較大。

中粒種種內遺傳距離為0.1210～0.5363，平均為0.3029;小粒種種內遺傳距離為0.0351～0.8129，平均為0.2229;大粒種種內遺傳距離為0.0445～0.0669，平均為0.0543;查理種種內遺傳距離為0.1387～0.3345，平均為0.2543?？梢姡辛７N種內遺傳距離最大，遺傳多樣性最豐富;其次為查理種，遺傳多樣性也較豐富;大粒種種內遺傳距離最小，遺傳多樣性最低。

2. 4 聚類分析結果

采用UPGMA對72份咖啡種質材料進行聚類分析。在遺傳相似系數(shù)0.5927處，72份材料可分為三大類，Ⅰ類群包括來自海南文昌和興隆的3份查理種和3份大粒種及1份中粒種巴布亞新幾內亞-2，遺傳相似系數(shù)為0.6484～0.9531;Ⅱ類群包括32份小粒種咖啡，遺傳相似系數(shù)為0.5234～0.9609;Ⅲ類群包括31份中粒種及1份福建咖啡和1份中小粒種雜交種Arabusta，共33份資源，遺傳相似系數(shù)為0.6641～0.8750。

Ⅰ類群在遺傳相似系數(shù)0.7592處，南頂、石壟坡、查理小果、查理大果、大粒種1和查理中果聚為一分支，并在遺傳相似系數(shù)0.6700處與巴布亞新幾內亞-2聚類為一類。

Ⅱ類群在遺傳相似系數(shù)0.5928處，分為2個分支，其中一支為綠頂M11，另一支為來自巴西、喀麥隆及我國臺灣、云南、廣西等地的32份種質。

Ⅲ類群在遺傳相似系數(shù)0.6823處，越南-3種質單獨成為一分支，其他32份種質在遺傳相似系數(shù)0.6913外又分為兩個分支，中小粒雜交種Arabusta咖啡單獨為一個分支，其他來自我國海南興隆、越南、馬來西亞、泰國、印度尼西亞及巴布亞新幾內亞等地的咖啡資源聚為一個分支。

綜上所述，72份咖啡材料間有較高的遺傳變異率，種間的差異比較明顯，說明ISSR分子標記可為咖啡種質的分類研究提供更多信息。

2. 5 主坐標分析結果

基于72份咖啡種質材料的遺傳相似系數(shù)矩陣進行主坐標分析。以排名前3位的矩陣特征值的貢獻指數(shù)分別占49.47%、19.38%和10.01%，占總貢獻的78.86%。72份咖啡種質材料分為三大簇，其中3份大粒種、3份查理種及1份中粒種（巴布亞新幾內亞-2）聚為一簇;32份小粒種聚為一簇;除巴布亞新幾內亞-2外的其他31份中粒種及1份中小粒雜交種Arabusta和1份福建咖啡共33份聚為一簇。主坐標分析與聚類分析結果一致，但主坐標分析比聚類分析更直觀地反映各咖啡種質間的親緣關系。

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎，是重要的遺傳資源。生物遺傳變異均發(fā)生在分子水平，在不斷進化過程中形成了豐富的遺傳多樣性（馬克平，1993;時圣明等，2016）。我國咖啡種質大多數(shù)是從國外引進，亟需對其種質資源進行創(chuàng)新改良，從而選育出適合我國種植的優(yōu)良品種。雖然目前我國云南和海南等地對咖啡種質資源進行收集保存，但對種質資源遺傳多樣性和親緣關系等方面的研究相對較少，嚴重阻礙了我國咖啡遺傳育種進程，進而限制咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究利用ISSR分子標記分析咖啡種質資源的遺傳多樣性，結果表明72份咖啡種質材料可分為三大類，遺傳相似系數(shù)0.4531～0.9609，說明這些材料遺傳背景相對較寬，存在較高的遺傳多樣性，與黃麗芳等（2014）的研究結果一致。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群親緣關系清晰，聚類分析結果與表型分類結果較一致，說明各種間存在較大的遺傳差異，其中Ⅲ類群主要為中粒種，遺傳相似系數(shù)0.6641～0.8750，說明種內遺傳差異較大。這可能與中粒種咖啡是異花授粉有關，在長期的繁殖過程中形成了大量遺傳變異。Hamrick和God（1990）也研究發(fā)現(xiàn)，多年生異花授粉植物具有較高遺傳多樣性，尤其在種內這種現(xiàn)象尤為明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，Ⅱ類群的小粒種咖啡親緣關系較緊密，遺傳相似系數(shù)為0.5234～0.9609，遺傳多樣性較低，推測與小粒種咖啡為自花授粉有關，還可能與我國現(xiàn)有小粒種咖啡種質資源大多為國外引進的栽培種，而野生種質引進較少有關。Anthony等（2002）利用AFLP和SSR分子標記對26份栽培種和半野生小粒種進行遺傳多樣性分析，結果表明兩種標記的聚類結果相似，半野生小粒種的遺傳多態(tài)性比栽培種高，但總體遺傳差異較小?？梢?，我國引進的小粒種咖啡育種親本范圍較狹窄，遺傳背景相似。

前人研究發(fā)現(xiàn)，種質資源的遺傳關系不僅與其地理來源有關，還與植物分類學特性、生長環(huán)境、功能用途等具有一定的相關性（Rotondi et al.，2003;陳海云等，2013;席春奕等，2013）。本研究的聚類分析結果表明，部分咖啡種質材料與地理來源相同或相近的種質材料聚在一起，但也有部分咖啡種質材料與地理來源不同的種質材料聚在一起，如Ⅱ類群的小粒種中，來自墨西哥的綠頂M11單獨聚為一個分支，而其他來自墨西哥的小粒種材料與來自巴西、喀麥隆及我國臺灣、云南、廣西等小粒種材料聚為另一個分支，且該分支中臺灣中部和云南貢山-2聚為一個分支，而臺灣小粒種、臺灣南部和云南貢山-1聚為另一個分支，說明同一產(chǎn)地的種質間也存在較大遺傳差異，導致聚類分析結果與來源地的相關性不明顯，推測是咖啡種質起源廣泛、進化過程漫長及人工選育栽培共同作用的結果（Martins et al.，2007）。

4 結論

咖啡種質資源各種間存在較大的遺傳差異，以中粒種種內遺傳多樣性較豐富，以小粒種種內遺傳多樣性較低。利用ISSR分子標記可準確分析咖啡資源遺傳多樣性。

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（責任編輯 陳 燕）