吳雪 張繼 邱淦遠 楊茂林 劉若余

摘要：【目的】明確堿基突變對江口蘿卜豬STAT3基因mRNA二級結構及其編碼蛋白二、三級結構的影響，為更好地開發(fā)利用江口蘿卜豬種質資源打下基礎。【方法】利用江口蘿卜豬血樣提取基因組DNA構建DNA池，采用混合DNA池結合PCR產物直接測序的方法對STAT3基因進行多態(tài)性分析，篩選出SNP多態(tài)位點及估算等位基因頻率，并進行生物信息學分析。【結果】從江口蘿卜豬血樣中擴增獲得STAT3基因的24個外顯子，并篩選出7個SNPs位點，分別是：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A。其中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A為同義突變，不改變其編碼氨基酸序列;Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A為錯義突變，會導致其編碼氨基酸發(fā)生改變。Exon22-C43>A突變后致使最小自由能降低為 -755.90 kcal/mol，結構穩(wěn)定性增強;Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變均促使最小自由能增加，分別為 -754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol，且導致mRNA二級結構改變，結構穩(wěn)定性降低，其中Exon5-G57>A突變導致mRNA二級結構完全改變。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A突變均可導致編碼蛋白二、三級結構的改變，具體表現(xiàn)為α-螺旋增加、β-折疊減少，而無規(guī)則卷曲除Exon2-A19>C突變呈增加趨勢外，其他突變均呈減少趨勢。其中，Exon2-G20>C突變對蛋白二級結構影響最大，而Exon2-A19>C突變的影響最小。【結論】從江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子上檢測出7個SNPs位點，其中Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4個為錯義突變，除了造成編碼氨基酸改變外，還導致mRNA及編碼蛋白二、三級結構的改變，進而可能對STAT3蛋白的功能造成影響。

關鍵詞： 江口蘿卜豬;STAT3基因;SNP位點;錯義突變;生物信息學

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0461-07

0 引言

【研究意義】江口蘿卜豬是貴州省的優(yōu)良地方豬種之一，主要分布于貴州銅仁市江口縣及其毗鄰的松桃和碧江等縣，具有耐粗飼、適應性強、肉質細嫩等特點，深受當?shù)厝罕姷南矏郏ㄑ嘀竞甑龋?010），但江口蘿卜豬存在生長緩慢、瘦肉率低等缺陷（毛同輝等，2015）。信號轉導及轉錄激活因子（Signal transducers and activators of transcription，STAT）是胞質中的調控因子，也是一種調控蛋白，具有N端片段保守序列、DNA結合區(qū)、SH2結構域、SH3結構域和C端轉錄激活區(qū)等功能區(qū)域（Isozaki et al.，2008）。JAK-STAT通路是細胞中的重要信號通路，負責調控多種細胞因子，包括生長激素等相關基因（Richard and Stephens，2011;Clifford and Ward，2013）。因此，深入研究STAT對江口蘿卜豬生長發(fā)育的調控機制，對利用分子輔助選育改良品種缺陷具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】STAT蛋白主要位于胞質中，當細胞因子與細胞膜上的受體結合，促使與受體偶聯(lián)的JAK活化，繼而結合STAT蛋白使其發(fā)生磷酸化修飾，活化STAT蛋白以二聚體的形式進入細胞核與靶基因結合，從而調控基因轉錄（Khatib et al.，2009;Wang and Huang，2010）。STAT蛋白家族總共有7個成員，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6（Kaplan，2013）。其中，STAT3是一種存在于細胞質中并在酪氨酸磷酸化信號通路中發(fā)揮關鍵作用的功能蛋白，也是一種細胞核轉錄因子，依賴于細胞因子或生長因子等配體的激活而調控基因表達（Buettner et al.，2002）。STAT3可與STAT1形成異源二聚體或自成同源二聚體進入細胞核與靶基因啟動子結合，而調節(jié)基因表達（Herrington et al.，2000）。STAT3最早被發(fā)現(xiàn)作為IL-6信號傳遞過程中的中介因子調控免疫反應（Hirano et al.，2000），近年來諸多研究相繼報道了STAT3的其他生理功能，如對肝臟快速反應蛋白的調控作用（Subramaniam et al.，2013），敲除STAT3基因導致早期胚胎死亡等（Ohkubo et al.，2013）。STAT3基因在瘦素介導下對生物體的能量平衡也具有一定作用（Wallenius et al.，2002;于月等，2013）。郭弈瑞（2014）研究表明，STAT3基因多態(tài)性與肥胖易感性具有一定的相關性;馬祖亮（2014）也研究發(fā)現(xiàn)，我國漢族人群中STAT3基因多態(tài)性具有影響超重、肥胖和脂類代謝紊亂的潛力。此外，STAT3蛋白可作為轉錄因子參與生長激素等調節(jié)過程，從轉錄水平上調節(jié)基因表達，繼而調控動物的生長發(fā)育。馬佩云（2010）以健康的雄性昆明小白鼠骨骼肌細胞為研究對象，分別采用AG490和IL-11進行處理，從細胞水平上證明JAK2-STAT3信號通路會對骨骼肌發(fā)育和能量代謝相關基因表達產生影響?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關STAT3基因在人類及結合JAK-STAT信號通路的研究較多，但STAT3基因在豬等家畜中的相關研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】構建江口蘿卜豬DNA池后直接測序分析，然后運用DNASTAR等在線軟件分析篩選出SNP多態(tài)位點及估算等位基因頻率，并進行生物信息學分析，明確堿基突變對江口蘿卜豬STAT3基因mRNA二級結構及其編碼蛋白二、三級結構的影響，為更好地開發(fā)利用江口蘿卜豬種質資源打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 DNA提取及DNA池構建

56頭江口蘿卜豬血樣均采自貴州江口縣，采用Ezup柱式基因組提取試劑盒（血液）提取基因組DNA。基因組DNA以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，DNA濃度使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計進行測量，每個樣本重復3次。將所有樣本DNA濃度調整至100 ng/μL，然后各取5.0 μL混合，構建DNA池。

1. 2 引物設計合成及PCR擴增

參考NCBI上已公布的豬STAT3基因序列（GenBank登錄號NC_010454.4），運用Primer Premier 5.0設計15對特異性引物，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，各引物序列及其最適退火溫度等信息見表1。PCR反應體系20.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s、72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 3 測序分析及等位基因頻率估算

選擇1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后條帶單一且明亮清晰的PCR擴增產物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。測序結果采用DNASTAR中的SeqMan分析測序峰圖，并與參考序列進行比對以篩選出SNP位點。同時，采用MWSnap v3.0測量等位基因對應的峰高，根據(jù)公式Ai=Bi/（B1+B2）估算等位基因頻率。

1. 4 生物信息學分析

采用RNAfold（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）預測單核苷酸突變前、后mRNA二級結構;運用PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）預測突變前、后編碼蛋白二級結構，并以SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）預測突變前、后編碼蛋白三級結構。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

以基因組DNA為模板，通過PCR分別擴增獲得江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子（Exon）片段，部分擴增產物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。清晰觀察到圖譜中的條帶單一、明亮清晰，且無拖帶等現(xiàn)象，說明擴增效果好，與預期效果相符。

2. 2 測序分析結果

擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，然后通過DNASTAR和BLAST等在線分析軟件與參考序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)其高度同源性，并篩選出7個SNPs位點。將各外顯子的第1個堿基定義為+1，則這7個SNPs位點分別為：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A。其中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A為同義突變，不會引起編碼氨基酸改變，但由于存在簡并密碼子且使用頻率不同，也可能會導致基因的表達差異;Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A為錯義突變，可導致其mRNA編碼氨基酸改變，具體表現(xiàn)（表2）：Exon2-A19>C突變導致絲氨酸突變?yōu)榫彼幔⊿er→Arg），Exon2-G20>C突變導致絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸（Ser→Thr），Exon5-C64>A突變導致谷氨酰胺突變?yōu)橘嚢彼幔℅ln→Lys），Exon22-C43>A突變導致脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚≒ro→Gln）。

2. 3 等位基因頻率估算結果

采用MWSnap v3.0測量江口蘿卜豬STAT3基因各SNP位點對應的峰高，計算出等位基因頻率。由表2可看出，2號外顯子（Exon2）上存在3個突變位點，且突變頻率均較高，而其他幾個外顯子上的突變頻率較低，說明相對于外顯子2，其他外顯子可能更加保守。

2. 4 生物信息學分析結果

2. 4. 1 mRNA二級結構預測結果 采用RNAfold預測江口蘿卜豬STAT3基因突變前后各基因型mRNA二級結構。Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon22-C43>A突變均未導致mRNA二級結構發(fā)生改變，僅Exon22-C43>A突變后致使最小自由能降低為-755.90 kcal/mol，結構穩(wěn)定性增強，而其他3個突變致使最小自由能分別增加至-754.00、 -754.60和-750.10 kcal/mol，導致結構穩(wěn)定性降低。Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變均促使最小自由能增加，分別為-754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol，且導致mRNA二級結構改變，結構穩(wěn)定性降低，其中，Exon5-G57>A突變導致mRNA二級結構完全改變，可能對蛋白翻譯有明顯影響。

2. 4. 2 編碼蛋白二級結構預測結果 采用PredictProtein對江口蘿卜豬STAT3基因不同基因型編碼蛋白二級結構進行預測，結果（表3）表明，Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A突變均會導致編碼蛋白二級結構的改變，具體表現(xiàn)為α-螺旋增加、β-折疊減少，而無規(guī)則卷曲除Exon2-A19>C突變呈增加趨勢外，其他突變均呈減少趨勢。其中，Exon2-G20>C突變對編碼蛋白二級結構影響最大，而Exon2-A19>C突變的影響最小。

2. 4. 3 編碼蛋白三級結構預測結果 利用SWISS-MODEL對江口蘿卜豬STAT3基因不同基因型編碼蛋白三級結構進行預測。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A、E-xon22-C43>A突變均會導致編碼蛋白三級結構發(fā)生改變。

3 討論

STAT蛋白家族是JAK-STAT信號通路中的重要調控因子，調控著多種細胞因子信號通路（Kaplan，2013）。STAT3是其中的重要一員，對生物的生長發(fā)育起重要調控作用。許多細胞因子受體，如表皮生長因子受體（EGFGR）、血管內皮生長因子受體（VEFGR）等均可促進STAT3活化，而參與生長調節(jié)過程（Chung et al.，2017）。當IL6和IL10等細胞因子與靶細胞表面受體結合后，此時受體還能結合同源或異源的寡聚蛋白，同時激活與其偶聯(lián)的JAKs;隨后激活的JAKs可促使STAT3蛋白C端的酪氨酸殘基磷酸化，進而形成同源二聚體或與STAT1形成異源二聚體進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用共同調節(jié)基因轉錄表達（宋舟等，2012）。STAT3在早期胚胎腦發(fā)育階段高度表達，但后期表達呈下調趨勢。早期STAT3基因高度表達有利于內源性神經干細胞的增殖和穩(wěn)定，后期表達下調則可促進相鄰細胞的神經元分化（Zhao et al.，2016）。此外，受外部刺激時，STAT3信號通路被激活并激發(fā)其C端酪氨酸705區(qū)磷酸化，提高運動神經元六聚物在STAT3信號通路上游信號的轉錄活動，而增強運動神經元六聚物的表達（Lee et al.，2013），說明STAT3基因對運動神經元的發(fā)育也有調控作用。楊永強等（2013）以務川黑牛和貴州荷斯坦奶牛構建DNA池并擴增STAT3基因啟動子，篩選出7個SNPs位點，發(fā)現(xiàn)Promoter322-A>G可能是影響肉牛生長性狀的重要功能性SNP位點;Tripathi等（2017）發(fā)現(xiàn)STAT3是調控人類Th17細胞早期分化的關鍵因子?？梢姡琒TAT3基因的研究不僅在疾病治療及預防上具有很高價值，還有助于揭示其對動物生長發(fā)育的作用機制。

本研究利用江口蘿卜豬血樣提取基因組DNA構建DNA池，首次從江口蘿卜豬血樣中擴增獲得STAT3基因的全部外顯子，并篩選出7個SNPs位點：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4- T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A，分別位于第2、4、5和22號外顯子上，其余外顯子均未檢測到SNP位點。說明其他外顯子相較于這4個外顯子可能更加保守，突變頻率更低，也可能由于樣本容量較小所致，具體原因有待進一步研究證實。在這7個SNPs位點中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A為同義突變，Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A為錯義突變。本研究還發(fā)現(xiàn)，外顯子2上3個突變位點的突變頻率均最高，說明其他外顯子相對更加保守。此外，通過預測堿基突變前后的mRNA二級結構，發(fā)現(xiàn)只有Exon22-C43>A突變后致使最小自由能減小為-755.90 kcal/mol，結構穩(wěn)定性增強，其他突變則導致最小自由能增加，穩(wěn)定性減弱，尤其是Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變導致mRNA二級結構改變，且有可能對STAT3蛋白的翻譯造成影響。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4個錯義突變還會導致編碼蛋白二級結構發(fā)生改變，如α-螺旋增加、β-折疊減少等，對編碼蛋白三級結構也有一定影響，但這些變化對STAT3蛋白的功能是否產生影響還有待進一步探究。

本研究從江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子上檢測出7個SNPs位點，且均無文獻記載;通過預測堿基突變前后的mRNA及翻譯蛋白結構，發(fā)現(xiàn)其中4個錯義突變有可能改變STAT3基因表達，而對江口蘿卜豬的生長發(fā)育造成影響。該結論有助于深入研究STAT3基因在豬生產性能開發(fā)上的作用，為江口蘿卜豬的分子育種打下基礎。

4 結論

從江口蘿卜豬STAT3基因的24個外顯子上檢測出7個SNPs位點，其中Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4個為錯義突變，除了造成編碼氨基酸改變外，還導致mRNA及編碼蛋白二、三級結構的改變，進而可能對STAT3蛋白的功能造成影響。

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（責任編輯 蘭宗寶）