劉 琴， 馬志健， 王杜娟， 左應(yīng)林， 仇 旭，王蘇美， 王夢(mèng)瑤， 王春華， 卜憲章△， 楊惠玲△

(1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州510080;2中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科，廣東 廣州510060;3中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州510080)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是東南亞及中國(guó)南部常見的惡性腫瘤［1］，EBV 病毒感染、基因易感性、飲食習(xí)慣和環(huán)境等因素在其發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。放療是NPC 治療的主要方式［2］，但由于輻射抗性所致的放療后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，嚴(yán)重制約了NPC 患者5 年生存率的提高，治療后的病人5 年生存率僅達(dá)到25%左右，因此，尋找逆轉(zhuǎn)輻射抗性的藥物是當(dāng)前NPC 治療的關(guān)鍵。

近來(lái)研究表明姜黃素(curcumin)可有效地抑制肺癌［3］、食管癌［4］、乳腺癌及肝癌［5］等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，通過(guò)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞周期阻滯等促使凋亡的發(fā)生，提高腫瘤的治療效果。但由于姜黃素溶解性差，分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且不穩(wěn)定，使人體對(duì)姜黃素的吸收及生物利用度低［6］，所以增強(qiáng)姜黃素生物活性為目的的衍生物變構(gòu)研究吸引了國(guó)內(nèi)外藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)和研究人員的關(guān)注。T63 是我們改構(gòu)的姜黃素衍生物之一，初篩表明T63 具有抗腫瘤效應(yīng)，可通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖［7］，但T63 是否具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗拒作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本文擬采用MTT 法、集落形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單獨(dú)放療組、藥物處理組或放療藥物聯(lián)合作用組對(duì)同源不同輻射抗拒的NPC 細(xì)胞CNE-2和CNE-2R 的活性、增殖能力、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并比較其中差異，以探討T63 對(duì)NPC 細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為尋找促進(jìn)放療敏感性和逆轉(zhuǎn)鼻咽癌輻射抗性的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

CNE-2 細(xì)胞由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供，CNE-2R 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其同源的鼻咽癌輻射耐受細(xì)胞株［8］。培養(yǎng)時(shí)在含有10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素及0.1 g/L 鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco);胰酶(華美生物工程公司);四甲基偶氮唑鹽［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT;Sigma］;二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO;上海生工);碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料(Sigma);膜聯(lián)蛋白(Annexin V)- 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

3 方法

3.1 細(xì)胞活性檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間(24 h、48 h 和72 h)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度接種到96 孔板中，貼壁后于各實(shí)驗(yàn)組再加相應(yīng)濃度藥物，對(duì)照組加入單純培養(yǎng)基。培養(yǎng)不同時(shí)間(24 h、48 h 和72 h)后加入20 μL MTT (5 g/L)溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h 后，棄板內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，之后避光置搖床上低速振蕩混勻，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)490 nm 測(cè)各孔的吸光度，計(jì)算CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞抑制率和IC50。

3.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種到6 孔板中(每孔200 個(gè)細(xì)胞)，貼壁后放療組用6 Gy 電離輻射(ionizing radiation，IR)照射，藥物組用0.1 μmol/L T63 作用，分為對(duì)照組、IR 組、T63 組及T63 與IR 聯(lián)合作用組。之后培養(yǎng)48 h 再棄上清，繼續(xù)培養(yǎng)8 ～12 d。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS 小心浸洗2次，自然干燥;加固定液1 mL 固定15 min，棄固定液，自然干燥后;加1 mL 姬姆薩染色30 ～60 min;用PBS 洗去染色液，自然干燥。顯微鏡下計(jì)算集落數(shù)，以≥50 個(gè)細(xì)胞作一個(gè)集落，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按下列公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞集落形成率:

3.3 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種到6 孔板中(每孔2 ×105個(gè)細(xì)胞)，貼壁后放療組用6 Gy IR 照射，藥物組用0.1 μmol/L T63 作用，分為對(duì)照組、IR 組、T63 組及T63 與IR 聯(lián)合作用組。之后培養(yǎng)24 h，消化收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于1 ×106個(gè)，離心棄上清，用PBS 洗2遍，并用Annexin V-FITC/PI 雙染標(biāo)記液100 μL 重懸，避光染色30 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率并分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3.4 細(xì)胞周期分布的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種到6 孔板中(每孔1 ×105個(gè)細(xì)胞)，貼壁后放療組用6 Gy IR 照射，藥物組用0.1 μmol/L T63 作用，分為對(duì)照組、IR 組、T63 組及T63 與IR 聯(lián)合作用組。之后培養(yǎng)24 h，消化收集細(xì)胞，各待檢標(biāo)本保證細(xì)胞總數(shù)不少于106個(gè)，離心棄上清，用PBS 洗2遍，75%乙醇固定，4 ℃過(guò)夜。第2 天離心棄上清，PBS 洗2 遍后，用含PI 50 mg/L 和RNA 酶20 mg/L的染色液0.5 mL 在4 ℃下避光染色30 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布并分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。采用SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 T63 增強(qiáng)放療抑制細(xì)胞活性和增殖的作用

MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著T63 藥物作用濃度的升高，細(xì)胞抑制率逐漸增高，細(xì)胞活性明顯受到抑制;對(duì)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞分別作用24、48 和72 h后，細(xì)胞抑制率增高，存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性，見圖1A、B。

集落形成實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)T63 或IR 單獨(dú)作用可使集落形成減少，而T63 與IR 聯(lián)合作用時(shí)，CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞集落形成率明顯降低，分別減少了80.2%和87.0%(P ＜0.05)，見圖1C。這表明T63能抑制CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞集落形成，且能促進(jìn)IR 抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用。

Figure 1. T63 and IR inhibited the viability (A，B)and proliferation (C)of NPC cells. Mean ±SD. n =3. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IR group.圖1 T63 和IR 抑制鼻咽癌細(xì)胞活性和增殖

2 T63 增強(qiáng)放療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T63 或IR 均可單獨(dú)誘導(dǎo)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞的凋亡(P ＜0.05);單獨(dú)IR作用誘導(dǎo)對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為20.0%，而聯(lián)合T63 處理CNE-2 細(xì)胞后，其凋亡率顯著升高為28.6%;在CNE2R 細(xì)胞中，IR 誘導(dǎo)對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為16.5%，聯(lián)合T63 后CNE-2R 細(xì)胞的凋亡率為40.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);且與CNE-2細(xì)胞相比，T63 與IR 聯(lián)合處理誘導(dǎo)CNE-2R 細(xì)胞的凋亡更顯著(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. T63 and IR induced apoptosis of NPC cells.Mean±SD. n =3. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IR group;△P ＜0.05 vs CNE-2 group.圖2 T63 和IR 誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡

3 T63 增強(qiáng)放療誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T63 或IR 作用對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。IR 單獨(dú)作用可誘導(dǎo)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞的G2/M 期阻滯，分別為11.0%和23.9%;與IR單獨(dú)作用組比，T63 與IR 聯(lián)合作用誘導(dǎo)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞G2/M 期阻滯更明顯，分別為34.8%和45.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖3。

討 論

Figure 3. T63 and IR induced G2/M arrest in NPC cells.Mean±SD. n=3. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs IR group.圖3 T63 和IR 誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞G2/M 期阻滯

隨著腫瘤輻射抗性的研究進(jìn)展，利用不同細(xì)胞或組織作為模型研究，并且避免遺傳背景差異和腫瘤組織異質(zhì)性等對(duì)結(jié)果的影響已經(jīng)引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外研究中，有許多研究建立了輻射誘導(dǎo)的輻射抗拒細(xì)胞株，包括肺癌細(xì)胞H69 和D6 的放射抗拒株(H69SCLCR 和D6-R)［9，10］以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGR2 的放射抗拒株(MGR2R)等［11］。我們采用爬坡式間隔性大劑量X 線誘導(dǎo)的分割方法照射誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2 得到了具有放射抗性的后代細(xì)胞CNE-2R，構(gòu)建具有相近遺傳背景的NPC 輻射抗性對(duì)比模型(CNE-2 和CNE-2R)［8］，這為NPC 輻射抗性相關(guān)研究提供了理想的對(duì)比模型，為進(jìn)一步研究人鼻咽癌細(xì)胞放射抗性的分子機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

姜黃素具有二-芳基庚二烯酮的基本結(jié)構(gòu)，包含了酚醛和β-二酮這2 種分子基團(tuán);目前，對(duì)姜黃素的改造也主要集中在這2 個(gè)活性基團(tuán)上［12］。已有研究表明姜黃素衍生物B50 和B67 能抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)G2/M 期阻滯［13-14］。T63 為本課題組改構(gòu)的姜黃素衍生物之一，有望超越姜黃素成為毒性較低，生物利用度高，且能逆轉(zhuǎn)輻射抗拒作用和促使腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥，見圖4。T63 作用于CNE-2 細(xì)胞的IC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于姜黃素作用的IC50［15］，因此，本文中我們對(duì)T63 是否具有放療增敏作用進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

Figure 4. Chemical structural formula of T63.圖4 T63 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

集落形成結(jié)果顯示T63 處理細(xì)胞后，其細(xì)胞增殖能力顯著降低，并能促進(jìn)NPC 細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。研究表明，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制之一［16］，因此，我們用Annexin VFITC/PI 雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物作用后的細(xì)胞凋亡 率，發(fā) 現(xiàn)T6 3 或IR 均 可 單 獨(dú) 誘 導(dǎo)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞的凋亡，且CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞被IR和T63 聯(lián)合作用后凋亡明顯增多(P ＜0.05)。

放療能誘導(dǎo)單鏈或雙鏈DNA 斷裂，導(dǎo)致DNA損傷，誘發(fā)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(checkpoint)的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)DNA 的修復(fù)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期的改變對(duì)DNA 的損傷修復(fù)具有重要影響，抑制DNA的損傷修復(fù)可提高細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。Hartwell等［17］研究發(fā)現(xiàn)G2期是DNA 合成后期，主要合成有絲分裂中新細(xì)胞形成所必需的物質(zhì)，它是決定細(xì)胞能否順利進(jìn)入M 期的關(guān)鍵。部分學(xué)者認(rèn)可G2/M 期阻滯與細(xì)胞輻射敏感性增強(qiáng)相關(guān)的觀點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)輻射高敏感的細(xì)胞株G0/G1期阻滯輕微、甚至缺乏，但卻有明顯的G2/M 期阻滯［18］。與此相符的是，Pawlik等［19］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期與細(xì)胞的輻射敏感性相關(guān):G2/M 期細(xì)胞的輻射敏感度最高，其次是G1期，S 期的細(xì)胞對(duì)射線的最不敏感。如果不敏感期的細(xì)胞比例增加，那么細(xì)胞在放射線照射時(shí)更有可能表現(xiàn)出抗拒性，所以促使誘導(dǎo)G2/M 期阻滯是提高腫瘤放療敏感性的一個(gè)重要途徑。Cui 等［20］研究發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合三氧化二砷能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M 期阻滯，提高食管癌的輻射敏感性。Khafif 等［21］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素作為潛在的抗癌藥物，能誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M 期阻滯，因此姜黃素能增加鱗狀細(xì)胞癌對(duì)輻射的敏感性。另外，Yan 等［22］研究發(fā)現(xiàn)IR 可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞G2/M 期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。與上述結(jié)論一致的是，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示IR 處理后細(xì)胞出現(xiàn)G2/M 期細(xì)胞比例增高;用低劑量T63與IR 聯(lián)合作用后，T63 能增強(qiáng)IR 誘導(dǎo)G2/M 期阻滯的作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞輻射抗拒的作用。

總之，通過(guò)T63 對(duì)CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞對(duì)比模型的研究發(fā)現(xiàn)，T63 或IR 均可單獨(dú)使CNE-2 和CNE-2R 細(xì)胞的增殖能力抑制，誘導(dǎo)凋亡和G2/M 期阻滯;與T63 或IR 單獨(dú)作用組比，T63 和IR 聯(lián)合作用的效果更明顯，提示T63 能增加NPC 的放療敏感性，具有放療增敏的潛在價(jià)值。

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