楊慧贊　童桂香　鄭曉聰　譚紅連　黃國秋　廖永志　韋信賢　胡庭俊

摘要：【目的】建立并優(yōu)化傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）檢測及其基因分型的套式PCR，并確定IHHNV在廣西流行的基因型，為有效防控廣西對蝦傳染性皮下及造血組織壞死?。↖HHN）提供參考依據(jù)?！痉椒ā吭谝訮CR檢測IHHNV現(xiàn)有標準的基礎(chǔ)上，于389F/R和309F/R兩對引物擴增片段之外的絕對保守區(qū)域設(shè)計外引物IHHNV-WF/WR，優(yōu)化退火溫度和引物濃度后建立IHHNV檢測及基因分型的套式PCR，并通過與一步法PCR對比以驗證其優(yōu)越性;采用建立的套式PCR對546株2010—2018年收集的IHHNV廣西流行株進行基因型分析，確定IHHNV在廣西流行的基因型?！窘Y(jié)果】優(yōu)化后的第一輪PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，無核菌酶滅菌水補足至20.0 μL。擴增程序：94.0 ℃預(yù)變性3 min;94.0 ℃ 10 s，59.0 ℃ 15 s，72.0 ℃ 15 s，進行35個循環(huán);72.0 ℃延伸5 min。套式PCR檢測IHHNV的靈敏度較一步法PCR提高100倍;對100份IHHNV陽性臨床樣品的檢測結(jié)果與一步法PCR的檢測結(jié)果一致，符合率達100%。從546株IHHNV廣西流行株中均能擴增獲得309 bp的目的條帶，全部為感染型（基因1型和基因2型）?！窘Y(jié)論】在PCR檢測IHHNV現(xiàn)有標準基礎(chǔ)上建立的IHHNV檢測及基因分型套式PCR，其靈敏度較一步法PCR提高100倍，尤其適用于檢測IHHNV含量低的樣品，可為疫病監(jiān)測及進出口檢疫提供更敏感的技術(shù)手段。當前廣西流行的IHHNV均為感染型（基因1型和基因2型）。

關(guān)鍵詞： 對蝦;傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）;套式PCR;基因型

中圖分類號： S945.46 ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-1127-06

Abstract：【Objective】The nested PCR detection methods were developed in order to provide technical support for detection and genotypes analysis of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）， and the genotypes of IHHNV epidemic in Guangxi were investigated to offer a reference for effective prevention and control of infectious subcutaneous and hematopoietic necrosis virus（IHHN） for prawn in Guangxi. 【Method】A pair of outer primers named IHHNV-WF/WR were designed on the conserved domain which located at both ends of primers 389F/R and 309F/R used in the present standards for PCR detection of IHHNV. Then the nested PCR detection methods were developed following optimization of annealing temperature and primers concentration. The superiority of the method was evaluated by comparing with former one-step PCR. A total of 546 IHHNV strains from Guangxi during 2010-2018 were conducted genotypes analy-sis using the nested PCR. The epidemic strains of IHHNV in Guangxi were identified. 【Result】The optimized first-round PCR ampli?cation reactions 20.0 μL included 10.0 μL of 2×F8 FastLong PCR Master Mix， 0.8 μL of upstream and downstream primers（20 μmol/L），2.0 μL of the DNA template and sterile water to a ?nal volume of 20.0 μL. PCR ampli?cation was carried out as follows：3 min initial denaturation step at 94 ℃; followed by 35 cycles of 94 ℃ for 10 s， 59 ℃ for 15 s and 72 ℃ for 15 s; with a ?nal extension step of 5 min at 72 ℃. The nested PCR methods developed were 100 times more sensitive than former one-step PCR methods. The nested PCR was used to detect 100 IHHNV-positive clinical samples， the results were consistent with former one-step PCR， coincidence rate was 100%. All 546 IHHNV epidemic strains from Guangxi could amplify 309 bp target bands， and they were infectious genotypes（genotype 1 and genotype 2）. 【Conclusion】The nested PCR methods developed in this study on the current basis for detection and genotypes analysis of IHHNV are 100 times more sensitive than former one-step PCR methods， and can provide more sensitive means for detecting IHHNV in surveillance and quarantine samples which contain small amount of IHHNV. IHHNV epidemic strains in Guangxi are all infectious genotypes（genotype 1 and genotype 2） at present.

Key words： prawn; infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）; nested PCR; genotypes

0 引言

【研究意義】傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）可感染世界各地的養(yǎng)殖及野生對蝦，感染后的危害程度因?qū)ξr種類或種群而異，感染凡納濱對蝦可引起矮小殘缺綜合癥（Runt-deformity syndrome，RDS），患病對蝦表現(xiàn)為生長緩慢、表皮畸形和產(chǎn)量下降（白麗蓉和趙志英，2012;童桂香等，2013;曾地剛等，2013）。感染IHHNV或患病后存活的對蝦終生帶毒，可通過垂直傳播和水平傳播將病毒傳給下一代及其他種群，因此生產(chǎn)上很難根除（Motte et al.，2003;韋信賢等，2011）。鑒于傳染性皮下及造血組織壞死病毒?。↖HHN）對養(yǎng)殖對蝦危害較大，已嚴重影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其劃定為甲殼類其他重要疫病之一，我國動物疫病病種名錄則將其劃為二類動物疫病。因此，開展IHHNV檢測方法研究及其流行株基因型分析，可為IHHN監(jiān)測提供更完善的檢測技術(shù)，并在生產(chǎn)上針對不同基因型毒株采取科學的防制措施?！厩叭搜芯窟M展】IHHNV是繼白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）后又一具有普遍感染性的對蝦病毒，曾在我國山東、上海、廣東和廣西等對蝦主要養(yǎng)殖地區(qū)普遍流行（童桂香等，2013）;雖然近幾年我國IHHNV陽性率整體上呈逐年下降趨勢，但除廣西的陽性率較低外（梁靜真等，2018），江蘇、遼寧和天津等地區(qū)的陽性率仍處在較高水平（鄧威等，2017;王博雅等，2017;王筱珊等，2017）。IHHNV已確定至少存在4種不同基因型（1型、2型、3A型和3B型），其中，基因1型和基因2型對對蝦有感染性，而基因3A型和基因3B型無感染性（Tang et al.，2003，2006）。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局于2013年更新了IHHNV檢疫的進出口行業(yè)標準，規(guī)定在入境水生動物的IHHNV檢疫中必須進行基因型檢測，檢出基因1型或基因2型IHHNV均不準入境（SN/T 1673—2013）。目前，基于PCR的多種檢測方法已被用于IHHNV檢測及其基因分型，其中389F/R和392F/R兩對引物能檢測IHHNV的4種基因型，可用于初篩;309F/R引物只能擴增IHHNV的基因1型和基因2型，宜用于感染型IHHNV檢測;MG831F/R引物只能擴增IHHNV的基因3A型和基因3B型，可用于非感染型IHHNV檢測（Tang et al.，2000，2007）。因此，我國IHHNV檢測標準（GB/T 25878—2010和SN/T 1673—2013）推薦，使用389F/R引物進行IHHNV檢測及采用309F/R或MG831F/R引物區(qū)分其感染型?！颈狙芯壳腥朦c】在實際檢疫工作中，采用389F/R和309F/R兩對引物進行IHHNV檢測和基因分型時不夠敏感，尤其在應(yīng)對IHHN常規(guī)監(jiān)測及進出口檢疫時，抽檢樣品多是采自健康無臨床癥狀的對蝦群體，其中的陽性樣品因病毒含量很低而極易造成假陰性，因此急需一種更靈敏且可靠的IHHNV檢測及其基因分型方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立并優(yōu)化IHHNV檢測及其基因分型的套式PCR，為IHHN監(jiān)測及基因分型提供更敏感、可靠的技術(shù)手段;同時確定IHHNV在廣西流行的基因型，為有效防控IHHN提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

546份2010—2018年收集的IHHNV陽性材料/DNA來自廣西沿海對蝦養(yǎng)殖場，由廣西水產(chǎn)科學研究院水生動物疫病監(jiān)控中心實驗室鑒定并保存。海洋動物組織基因組DNA快速提取試劑盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix和DL2000 DNA Marker購自北京艾德萊生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 引物設(shè)計與合成

從GenBank中下載不同地域IHHNV的序列（4種基因型），采用MegAlign中的ClustalW進行同源性比對分析，在389F/R和309F/R兩對引物擴增片段之外的絕對保守區(qū)域設(shè)計外引物IHHNV-WF/WR，各引物信息見表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 病毒DNA提取

仔蝦和幼蝦取整只蝦或蝦頭（幼蝦需去眼），成蝦取鰓和肝胰腺組織。將1.0 g樣品放入2 mL滅菌勻漿試管中，經(jīng)勻漿器勻漿后取30 mg，以海洋動物組織基因組DNA快速提取試劑盒提取總DNA，最后加50.0 μL洗脫緩沖液EB溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 IHHNV套式PCR建立

參考IHHNV-WF/WR引物的退火溫度（54.2和54.7 ℃）在50.0～60.0 ℃范圍內(nèi)進行退火溫度優(yōu)化，篩選出最適退火溫度;然后在最適退火溫度下，對不同引物終濃度（0.1～1.0 μmol/L）進行PCR擴增，確定最佳引物濃度;確定IHHNV第一輪PCR的反應(yīng)體系及擴增程序。以IHHNV-WF/WR為外引物進行第一輪PCR擴增;以389F/R為內(nèi)引物，按照GB/T 25878—2010《對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）檢測PCR法》進行IHHNV檢測;同時以309F/R為內(nèi)引物，按照SN/T 1673—2013《傳染性皮下及造血組織壞死檢疫技術(shù)規(guī)范》進行IHHNV基因分型。

1. 5 套式PCR敏感性驗證

將IHHNV陽性DNA進行10倍梯度稀釋（100～10-5），取2.0 μL各梯度DNA為模板進行套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R和309F/R分別為內(nèi)引物）和一步法PCR（389F/R引物和309F/R引物直接擴增）檢測，對比二者的敏感性。

1. 6 套式PCR臨床檢測

采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R為內(nèi)引物）和一步法PCR（389F/R為引物）同時對100份IHHNV陽性臨床樣品（強陽性和弱陽性）進行檢測，以檢驗套式PCR的臨床實用性。

1. 7 IHHNV廣西流行株基因型分析

采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，309F/R為內(nèi)引物）對546份2010—2018年收集的IHHNV陽性DNA（389F/R引物檢測為陽性）進行基因分型，對309F/R引物檢測為陰性的樣品用MG831F/R引物進行檢測，以了解IHHNV廣西流行株的基因型。

2 結(jié)果與分析

2. 1 IHHNV第一輪PCR擴增反應(yīng)條件

IHHNV-WF/WR引物在退火溫度為50.0～60.0 ℃的PCR擴增結(jié)果見圖1。隨退火溫度的升高，PCR擴增效率也逐漸提高，退火溫度低于56.4 ℃（泳道7）時，其擴增效率較低且有非特異性條帶存在;當退火溫度為57.4～59.7 ℃（泳道8～10）時，目的基因的擴增效率高且不存在非特異性擴增，故選取59.0 ℃為第一輪PCR的退火溫度。比較不同引物濃度的PCR擴增效果，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)引物終濃度低于0.7 μmol/L（泳道7）時，隨引物濃度的降低其擴增效率也逐漸下降;當引物終濃度為0.8～1.0 μmol/L（泳道8～10）時，目的基因的擴增效率高且差異不明顯，故選取0.8 μmol/L為最佳引物終濃度。優(yōu)化后的第一輪PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，無核酸酶滅菌水補足至20.0 μL。擴增程序：94.0 ℃預(yù)變性3 min;94.0 ℃ 10 s，59.0 ℃ 15 s，72.0 ℃ 15 s，進行35個循環(huán);72.0 ℃延伸5 min，4.0 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 2 套式PCR與一步法PCR的敏感性比較

采用套式PCR和一步法PCR同時對10倍梯度稀釋的IHHNV陽性DNA（100～10-5）進行檢測，結(jié)果（圖3和圖4）顯示，套式PCR可檢測到10-4稀釋度的陽性DNA，而一步法PCR僅檢測到10-2稀釋度的陽性DNA，說明套式PCR的敏感度較一步法PCR提高100倍。

2. 3 套式PCR的臨床檢測結(jié)果

采用套式PCR和一步法PCR對100份IHHNV陽性臨床樣品進行檢測的結(jié)果均呈陽性，符合率達100%;且一步法PCR檢測為弱陽性的樣品采用套式PCR可獲得明亮的電泳條帶（圖5），說明套式PCR較一步法PCR對目的片段的擴增更高效。

2. 4 IHHNV廣西流行株基因型分析結(jié)果

采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物、309F/R為內(nèi)引物）對546份2010—2018年收集的IHHNV陽性DNA進行擴增，結(jié)果顯示均能擴增獲得309 bp的目的條帶（圖6），說明546株IHHNV廣西流行株全部為感染型（基因1型和基因2型）。

3 討論

自IHHNV被發(fā)現(xiàn)以來，其檢測方法不斷發(fā)展更新，已有多種免疫學和分子生物學方法可用于實際生產(chǎn)或相關(guān)研究，如ELISA、斑點雜交、PCR、實時熒光定量PCR和LAMP等，這些檢測方法各具優(yōu)缺點。國內(nèi)現(xiàn)行的IHHNV檢測標準（GB/T 25878—2010和SN/T 1673—2013）仍推薦使用PCR，但在實際檢測工作中不管是對IHHNV進行檢測還是基因分型時，采用現(xiàn)有標準的一步法PCR均暴露出敏感性較弱的缺陷，主要體現(xiàn)在對IHHNV含量低的樣品難以檢出或條帶很弱而無法定論，且易造成假陰性。因此，亟需對現(xiàn)行IHHNV檢測標準的PCR進行改進和優(yōu)化，以滿足對低含量IHHNV檢測的需求。套式PCR是以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進行第二輪擴增，即采用兩對特異性引物對目的片段進行兩輪擴增，其特異性和靈敏度相對于一步法PCR均得到有效提高。此外，對蝦WSSV、對蝦黃頭病毒（Yellow head disease，YHV）和鯉春病毒血癥病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）等水生動物病原的檢測標準均已采用套式PCR（謝數(shù)濤等，2001;林婧楠等，2018），說明采用套式PCR檢測水生動物病原具有一定優(yōu)越性。

本研究在以PCR檢測IHHNV現(xiàn)有標準的基礎(chǔ)上，設(shè)計外引物IHHNV-WF/WR，并對第一輪PCR的退火溫度和引物濃度進行優(yōu)化，建立了適用于IHHNV檢測（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R為內(nèi)引物）及基因分型（IHHNV-WF/WR為外引物，309F/R為內(nèi)引物）的套式PCR，其檢測IHHNV的靈敏度較一步法PCR提高100倍;采用套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，389F/R分別為內(nèi)引物）對100份IHHNV陽性臨床樣品進行檢測，檢測結(jié)果與一步法PCR的符合率達100%，且一步法PCR檢測為弱陽性的樣品采用套式PCR可獲得明亮的電泳條帶，說明建立的套式PCR應(yīng)用于IHHNV檢測切實可靠，且較一步法PCR的擴增更高效，即對IHHNV含量低的樣品進行檢測時推薦使用套式PCR。

IHHNV的基因型可分為感染型和非感染型，其中，感染型包括基因1型和基因2型，可感染凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦等代表性對蝦;非感染型包括基因3A型和基因3B型，認為是IHHNV的部分基因片段鑲嵌于斑節(jié)對蝦基因中（Saksmerprome et al.，2010）。本研究采用建立的套式PCR（IHHNV-WF/WR為外引物，309F/R引物為內(nèi)引物）對546份2010—2018年收集的IHHNV陽性DNA進行檢測，結(jié)果顯示均能擴增獲得309 bp的目的條帶，表明546株IHHNV廣西流行株全部為感染型（基因1型和基因2型）。袁顏顏等（2015）利用4對引物（389F/R、392F/R、77012F/77353R和309F/R）對2011—2012年采自國內(nèi)不同地區(qū)的對蝦樣品進行IHHNV檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有IHHNV可分為4種PCR檢出類型，其中有48份樣品以389F/R和309F/R引物均檢出陽性（48/49），屬于感染型?，F(xiàn)有的研究資料表明，IHHNV基因1型分布于美國和東亞地區(qū)（主要是菲律賓），基因2型分布于東南亞地區(qū)，基因3A型分布于東非地區(qū)、印度和澳大利亞，基因3B型分布于印度太平洋地區(qū)包括馬達加斯加、毛里求斯和坦桑尼亞（Tang et al.，2003，2006）。綜合本研究結(jié)果可知，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)IHHNV非感染型（基因3A型和基因3B型），是否與我國的對蝦養(yǎng)殖習慣或現(xiàn)有檢測IHHNV非感染型（基因3A型和基因3B型）的引物不理想有關(guān)，尚需進一步研究證實。

4 結(jié)論

在PCR檢測IHHNV現(xiàn)有標準基礎(chǔ)上建立的IHHNV檢測及基因分型套式PCR，其靈敏度較一步法PCR提高100倍，尤其適用于檢測IHHNV含量低的樣品，可為疫病監(jiān)測及進出口檢疫提供更敏感的技術(shù)手段。當前廣西流行的IHHNV均為感染型（基因1型和基因2型）。

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（責任編輯 蘭宗寶）