李軍山　李雪利　高杰　高晗　張肖建　孫福仁　牛麗穎

摘 要：為了使巴戟天配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)規(guī)范，通過(guò)對(duì)15批產(chǎn)自不同地區(qū)的巴戟天飲片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備，以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑干膏粉進(jìn)行研究，確定了巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍;采用高效液相色譜法對(duì)主含成分耐斯糖進(jìn)行了含量測(cè)定，研究了巴戟天配方顆粒的PLC特征圖譜分析方法，并對(duì)特征譜圖中的水晶蘭苷進(jìn)行了指認(rèn)。結(jié)果表明，在以流動(dòng)相作為提取溶劑、甲醇-水（二者體積比為3∶97）為流動(dòng)相的條件下，耐斯糖含量的轉(zhuǎn)移率范圍為73.21%～94.49%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍為49.05%～55.87%。基于巴戟天配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜研究方法嚴(yán)謹(jǐn)、可行，更加科學(xué)地闡明了配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究的一致性。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);巴戟天;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;轉(zhuǎn)移率;出膏率;特征圖譜

中圖分類號(hào)：R284.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract： In order to make the quality standard of Morinda officinalis ow prescription granules more scientific and standardized， 15 batches of Morinda officinalis ow decoction pieces produced in different regions are prepared with standard decoction， and the dry extract powder of standard decoction is studied to determine the range of extraction rate of Morinda officinalis standard decoction. The content of the main component Nystose is determined by high performance liquid chromatography. The PLC characteristic chromatogram analysis method of Morinda officinalis ow prescription granules is researched， and the crystal glycoside in the characteristic chromatogram is identified. The results show that under the flow phase as extraction solvent， methanol-water（3∶97） as mobile phase， the transfer rate of nesaccharide content is in the range of 73.21%～94.49% ， and the extraction rate of standard decoction is in the range of 49.05%～55.87%. The quality standard established by the standard decoctio

n characteristic map research institute based on Morinda officinalis ow prescription granules is rigorous and feasible， which more scientifically illustrates the consistency between the prescription granules and the standard decoction research.

Keywords：chemistry of Chinese material medica; Morinda officinalis ow; standard decoction; transfer rate; extraction rate; characteristic chromatograms[T][ST][2*2]

巴戟天為茜草科植物巴戟天[WTBX]Morinda officinalis ow的干燥根[1]，是中國(guó)著名的“四大南藥”之一[2]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3]，味甘辛，性微溫，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效，用于治療陽(yáng)痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟等[4]。巴戟天藥材中主要含有蒽醌類、環(huán)烯醚萜苷類、多糖類等成分[5-7]。其中，蒽醌類化合物主要有2-羥基-1-甲氧基蒽醌、rubiasin A和rubiasin B等，均具有抗菌、降壓、降脂、抗癌、抗病毒、凝血等活性[8]。環(huán)烯醚萜苷類化合物主要包括水晶蘭苷[9]、四乙酰車葉草苷[10]等，具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用。目前，從巴戟天中分離得到的糖類主要有水溶性多糖（MOP-1）、甘露糖、巴戟甲素（原稱巴戟素）、耐斯糖等多種低聚糖，研究表明其具有顯著的抗抑郁作用。

飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，其規(guī)范了工藝參數(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立原則[11]。配方顆粒的各項(xiàng)指標(biāo)及生產(chǎn)過(guò)程必須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相吻合。本研究按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法，以采自15個(gè)不同產(chǎn)地的巴戟天飲片為原料制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測(cè)定15批巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的干膏量，確定出膏率范圍，并對(duì)耐斯糖進(jìn)行含量測(cè)定，確定含量及轉(zhuǎn)移率范圍。經(jīng)過(guò)方法摸索，得出巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的PLC特征圖譜，以期使巴戟天配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)和規(guī)范。

1 主要儀器與試藥

Shimadzu Corporation LC-20AT高效液相色譜儀，Sartouius CPA225D分析天平，水循環(huán)真空泵，SENCO Technology Co.Ltd.提供;M-A5002電子天平，浙江余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司提供;DG-9140A干燥箱，江蘇太倉(cāng)精宏儀器設(shè)備有限公司提供;超聲波清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供。

耐斯糖對(duì)照品，批號(hào)為111891-201403;水晶蘭苷對(duì)照品，批號(hào)為111870-201303;乙腈，批號(hào)為20161014;甲醇，色譜純，批號(hào)為20161020;水，純化水;磷酸，分析純。

巴戟天藥材共計(jì)15批，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠老師鑒定為正品，樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品制備

取巴戟天飲片100 g，放入2 L圓底燒瓶中，加水提取2次。第一煎加水900 mL，先泡30 min，然后開(kāi)啟加熱，煮沸后計(jì)時(shí)60 min;第二煎加水700 mL，煮沸后計(jì)時(shí)40 min。合并2次煎液，使用孔徑為0.048 mm的過(guò)濾材質(zhì)，在藥液熱時(shí)進(jìn)行過(guò)濾。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于低溫（55 ℃，-0.095 MPa）濃縮，濃縮至相對(duì)密度為1.03～1.06（55 ℃）的流浸膏，放置在不銹鋼盤中冷凍干燥，制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末[12-18]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中耐斯糖含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相組成水與甲醇體積比為97∶3，采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，理論塔板數(shù)按耐斯糖峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取耐斯糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相，制成每1? mL含200 μg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑0.2 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50 mL，稱重，于沸水浴中加熱30 min，放冷，再次稱重，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，即得[19]。

2.2.4 測(cè)定方法

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL、對(duì)照品溶液30 μL、供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液50，100，200，300，400 μL，按“221”所述條件進(jìn)樣分析，縱坐標(biāo)為耐斯糖峰面積的對(duì)數(shù)值，橫坐標(biāo)為耐斯糖進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，耐斯糖進(jìn)樣量在1041 9～8334 9 mg范圍內(nèi)，回歸方程為Y=1582 9X+5533×10-1，r=0999 7，表明線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)3，下同），按“2.2.3”所述方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定峰面積（耐斯糖）的RSD值為0.87%，結(jié)果表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.2.3”所述方法制備供試品溶液，在1，3，6，10，14，18 h進(jìn)樣測(cè)定耐斯糖含量。經(jīng)計(jì)算，各樣品中耐斯糖峰面積的RSD值為1.56%，說(shuō)明18 h內(nèi)此樣品溶液穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品供試品6份，每份0.2 g，精密稱定。按“2.2.3”所述方法處理標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“2.2.1”所述條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算供試品中耐斯糖含量。6份供試品中耐斯糖含量的RSD值為1.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，共計(jì)9份，每份約0.1 g，每3份為一組。于每組中精密加入耐斯糖對(duì)照品相當(dāng)于巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含耐斯糖量的80%，100%，120%，置于具塞錐形瓶中，按“2.2.1”所述條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，耐斯糖平均加標(biāo)回收率為10080%，加標(biāo)回收率RSD值為1.51%。表明本方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及含量測(cè)定

按“2.1”所述方法制備15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的計(jì)算取標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末質(zhì)量（[WTBX]m2）與巴戟天飲片質(zhì)量（m1）之比值。按“2.2”所述方法測(cè)定巴戟天飲片、巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量，得到含量轉(zhuǎn)移率。15批巴戟天飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表3。

出膏率=m2/m1，含量轉(zhuǎn)移率=[SX（]標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量×出膏率飲片含量[SX）]×100% 。

從表3可以看出，15批巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為49.05%～55.87%，出膏率平均值為52.08%，SD值為2.24;標(biāo)準(zhǔn)湯劑中耐斯糖含量范圍為70.91～92.45 mg/g，平均值為82.55 mg/g，SD值為7.71;耐斯糖含量轉(zhuǎn)移率范圍為73.21%～94.49%，均值為84.05%，SD值為4.88。

3 巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的建立

3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.03%磷酸溶液，按表4比例進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm;流速：1 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備?

精密稱取水晶蘭苷對(duì)照品12.5 mg，置于50 mL量瓶中，加入25%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇定容，制成每1 mL含水晶蘭苷0.25 mg的對(duì)照品溶液，即得。水晶蘭苷對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖1。

3.3 供試品溶液的制備

取本品0.3 g，精密稱定，置于磨口三角瓶中。精密量取25%甲醇25 mL，加入三角瓶中，稱重，密塞，超聲處理30 min，放至室溫后再次稱定質(zhì)量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得[20-21]。巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜見(jiàn)圖2。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度

取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)3），按“3.3”所述方法處理樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，以水晶蘭苷為S峰，計(jì)算其他主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）及相對(duì)峰面積（RPA）。結(jié)果顯示，各峰RRT的RSD值<0.8%，RPA的RSD值<21%，表明儀器的精密度良好。

3.4.2 穩(wěn)定性

取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的樣品溶液，按“3.1”所述條件，分別在0，3，6，9，12，15，18 h進(jìn)樣分析，以水晶蘭苷為參照物峰，計(jì)算其他色譜峰的RRT及RPA。結(jié)果表明，各峰RRT的RSD值<0.7%，RPA的RSD值<2.2%，表明在18 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。

3.4.3 重復(fù)性

取巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品（標(biāo)3），按“3.3”所述方法制備供試品溶液，制備平行樣品6份，按“3.1”所述條件進(jìn)樣分析，以水晶蘭苷為參照物峰，計(jì)算其他色譜峰的RRT及RPA。結(jié)果表明，各峰RRT的RSD值<1.4%，RPA的RSD值<2.9%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.5 樣品測(cè)定

取按“2.1”所述方法制得的樣品，按照“3.3”所述方法制備樣品溶液，分別進(jìn)樣，按“3.1”色譜條件測(cè)定PLC圖譜。測(cè)定完成后，把15批PLC圖譜導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件中進(jìn)行分析，見(jiàn)圖3。15批巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑共呈現(xiàn)7個(gè)共有特征峰，以2號(hào)峰水晶蘭苷為參照峰，計(jì)算7個(gè)共有色譜峰的RRT及RPA，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

結(jié)果表明，15批巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑各特征峰的RRT均在規(guī)定值±5%范圍內(nèi)：峰1（0.81）、峰2（100）、峰3（1.30）、峰4（3.09）、峰5（3.42）、峰6（376）、峰7（4.25）。

4 討 論

4.1 提取溶劑

在巴戟天配方標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜樣品的制備方法中，考察了純化水、無(wú)水乙醇、100%甲醇、70%甲醇、25%甲醇、70%乙醇、20%乙醇共7種提取溶劑，以色譜峰個(gè)數(shù)、基線穩(wěn)定性等為考察指標(biāo)，最終確定用25%甲醇進(jìn)行樣品溶液的制備。

4.2 流動(dòng)相

在特征圖譜條件摸索階段，對(duì)有機(jī)相考察了甲醇、乙腈，對(duì)水相考察了0.1%磷酸、0.1%冰醋酸、003%磷酸及水對(duì)反應(yīng)的影響情況。通過(guò)對(duì)比色譜圖發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為乙腈-0.03%磷酸時(shí)，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離良好，因此選用乙腈-0.03%磷酸作為流動(dòng)相。

4.3 色譜柱及柱溫

考察了ZORBAX Eclipse Plus C18及InertSustain AQ-C18色譜柱，以及柱溫為25，30，35 ℃對(duì)反應(yīng)的影響情況。結(jié)果顯示，采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱、柱溫為30 ℃時(shí)的效果最優(yōu)。

4.4 提取用純化水、飲用水

先后考察了采用符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求的純化水、飲用水提取時(shí)的差異情況。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，提取效果受提取用水的影響也較小。

4.5 浸泡時(shí)間

先后考察了不浸泡、浸泡30 min、浸泡60 min對(duì)反應(yīng)的影響情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸泡時(shí)間對(duì)提取效果的影響也較小。

5 結(jié) 語(yǔ)

1） 對(duì)15批不同產(chǎn)地的巴戟天飲片進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑干膏粉進(jìn)行了研究，確定了巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍，為巴戟天配方顆粒量的確定提供了可靠數(shù)據(jù)。

2） 通過(guò)采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，明確了巴戟天標(biāo)準(zhǔn)湯劑中耐斯糖含量的測(cè)定及特征圖譜分析方法，闡明了配方顆粒與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性。

3） 本研究對(duì)巴戟天配方顆粒水溶性多糖耐斯糖進(jìn)行了含量及轉(zhuǎn)移率的考察，但在特征圖譜部分只對(duì)環(huán)烯醚萜苷類成分中的水晶蘭苷進(jìn)行了色譜峰指認(rèn)，后續(xù)將對(duì)指紋圖譜中其他6個(gè)特征峰進(jìn)行研究，以獲得更多的信息，更好地監(jiān)控巴戟天配方顆粒的質(zhì)量。

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