楊華

摘? ?要：主要介紹了水稻品種真實性鑒定室內(nèi)分子檢測的能力驗證方法，探討了聚丙烯酰胺凝膠、QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳和熒光毛細(xì)管電泳3種不同檢測方法的應(yīng)用分析和比較。各實驗室可以根據(jù)實際情況選擇合適的方法開展能力驗證以及日常的檢測工作。

關(guān)鍵詞：農(nóng)作物;種子質(zhì)量;檢測能力;驗證;品種;真實性;分子檢測

文章編號： 1005-2690（2019）06-0127-03? ? ? ?中圖分類號： S339.31;S511? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： B

農(nóng)作物品種真實性鑒定一直是種子檢測中的重點和難點，因為近年來種子市場上假冒偽劣、套牌侵權(quán)等違法行為屢禁不止，而傳統(tǒng)的檢測方法為田間種植鑒定，其需要在作物整個生長發(fā)育期間，田間觀察其特征特性并與標(biāo)準(zhǔn)樣品進行比對，根據(jù)明顯的性狀差異來鑒定品種真實性，鑒定周期至少為一個生產(chǎn)周期，有時候待鑒定結(jié)果出來時，違法行為的證據(jù)都已經(jīng)過期或者消失，無法快速有效地打擊種子市場上的違法行為。但是近年來隨著分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定中的廣泛研究和發(fā)展，這種快速、高效的檢測方法已經(jīng)開始彰顯優(yōu)勢。

2015年5月29日，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會批準(zhǔn)的國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程 真實性和品種純度鑒定》第1號修改單規(guī)定，品種真實性或分子身份允許采用SSR和SNP分析標(biāo)記方法。這一規(guī)定使SSR分子標(biāo)記法同傳統(tǒng)的田間種植鑒定一樣成為國家標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的品種真實性鑒定方法。2016年1月1日修訂后實施的新《種子法》第四十六條中明確規(guī)定，農(nóng)業(yè)、林業(yè)主管部門可以采用國家規(guī)定的快速檢測方法對生產(chǎn)經(jīng)營的種子品種進行檢測，檢測結(jié)果可以作為行政處罰依據(jù)。這款法律條文明確了快速檢測方法的法律地位，至此地方法院在審理種子案件、農(nóng)業(yè)部門在查處假冒侵權(quán)等案件中，可以依據(jù)分子標(biāo)記快速檢測技術(shù)查處有關(guān)的違法行為。

江蘇省于2014年通過了原農(nóng)業(yè)部資質(zhì)認(rèn)定，取得了水稻品種真實性室內(nèi)分子檢測的資質(zhì)，成為首批獲得分子檢測資質(zhì)的省級種子質(zhì)量檢測機構(gòu)。檢驗中心自取得資質(zhì)后在2014—2017年種子市場監(jiān)管中，分子檢測技術(shù)發(fā)揮了無可替代的作用，為多起種子案件提供了強有力的技術(shù)支持和保障。為了不斷提高中心的檢測水平，中心技術(shù)人員每年都參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的農(nóng)作物種子品種真實性室內(nèi)檢測能力驗證。本文就2017年參加的水稻品種真實性室內(nèi)分子檢測能力驗證進行了分析和總結(jié)。

1? ?試驗材料

試驗中用到的水稻種子樣品，由能力驗證組織方——全國農(nóng)技推廣中心種子檢驗處提供。共7個種子樣品，分別為對照CK08、CK24和待測樣稻DC036、稻DC037、稻DC038、稻DC039、稻DC040。

2? ?試劑耗材

植物基因組DNA提取試劑盒（DNA secure Plant Kit）天根生物公司;Taq酶（Premix Taq）TAKARA。

3? ?試驗儀器

種子粉碎設(shè)備（SPEX Geno2010 美國）;PCR儀（Agilent）;微量紫外分光光度計（Thermo Scientific ND2000）;聚丙烯酰胺凝膠電泳儀/槽（北京六一/北京君意）;伯樂（Bio-RAD）公司的Gel Dox XR+型號凝膠成像系統(tǒng)進行掃膠成像;瓊脂糖毛細(xì)管電泳設(shè)備（QIAxcel Advanced 全自動核酸分析儀）;熒光毛細(xì)管電泳設(shè)備（ABI）。

4? ?試驗方法

4.1? ?DNA提取

本試驗采用水稻干種子直接提取的方法，每個樣品取20粒種子的混株樣品，使用粉碎設(shè)備磨碎后，用DNA提取試劑盒提取水稻全基因組DNA，詳細(xì)方法見試劑盒說明書。提取的DNA用微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋到50 ng/μL備用。

4.2? ?PCR擴增

采用能力驗證指導(dǎo)書中規(guī)定的10對引物進行PCR擴增，內(nèi)容見表1。

反應(yīng)體系為16.5 μL Taq酶混合物，1.5 μL DNA模板，2 μL上下游引物的混合物（其中進行熒光毛細(xì)管電泳的引物5’端標(biāo)記熒光集團）;反應(yīng)程序為94 ℃下預(yù)變性2 min;進行32次擴增反應(yīng)循環(huán)（94 ℃下變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸1 min）;然后72 ℃下延伸8 min;最后10 ℃恒溫冷卻。

4.3? ?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測的具體方法進行電泳和染色。染色后用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Mage Lab 4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

4.4? ?瓊脂糖毛細(xì)管電泳檢測

按照儀器操作手冊，將PCR產(chǎn)物放在儀器樣品分析臺上直接進行毛細(xì)管電泳分析，并用儀器自帶的分析軟件（QIAxcel ScreenGel）進行數(shù)據(jù)分析。

4.5? ?熒光毛細(xì)管電泳檢測

將PCR產(chǎn)物稀釋40倍后，分別吸取1 μL加入到分析儀專用的96孔板中，每個孔分別加入0.1 μL內(nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺，變性處理并離心后放在分析儀上進行電泳，并用Gene Mapper Software 5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

5? ?結(jié)果和分析

5.1? ?聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法步驟，以及本實驗室的優(yōu)化，每個檢測位點都得到了清晰電泳圖，以P01和P03兩個位點的圖為例，見圖1。并根據(jù)指紋圖譜對10個位點進行了讀圖分析，得到了最終的結(jié)果，見表2和表3。

5.2? ?QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳結(jié)果

本試驗中應(yīng)用的QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳是一種新型的瓊脂糖電泳，此方法是通過將溴化乙錠染色的瓊脂糖膠制成一種預(yù)制卡夾微光采集器，片段在卡夾毛細(xì)管中移動時通過一系列激光二極管，激發(fā)并檢測信號，信號通過光電倍增管傳至進行數(shù)據(jù)分析的軟件中，通過軟件分析生成模擬的電泳圖譜，圖譜中顯示每條毛細(xì)管中片段的帶型，以P01和P03兩個位點的圖為例，見圖2，圖型清晰，便于分析。

5.3? ?毛細(xì)管電泳分析

本試驗通過標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定方法和部分步驟優(yōu)化后，在ABI3700基因分析儀器上利用熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進行毛細(xì)管電泳分析擴增產(chǎn)物的片段類型和大小，以P01和P03兩個位點的圖為例，見圖3、圖4。圖中顯示兩個對照和5個樣品在這兩個位點上擴增片段的信號強，帶型清晰，具有各自特異的帶型，并且通過軟件分析能得出每個片段的大小數(shù)值。表4為兩個對照品種和4個樣品在P01和P03兩個位點上的片段大小。

5.4? ?能力驗證結(jié)果判定

通過分析3種電泳結(jié)果各自的圖譜或峰值圖，均得到了一致的判定結(jié)果。與對照樣品CK08相比，DC036號樣品10個位點上均無差異;DC038號樣品在P06位點上有1個差異，其他位點無差異;DC037、DC039號樣品只在P02位點上無差異，其他位點均有差異;DC040號樣品與對照樣品在10個位點上均有差異，詳見表2。

與對照樣品CK24相比，DC037號樣品在10個位點上均無差異;DC039號樣品在P05位點上有1個差異，其他位點均無差異;DC036、DC038號樣品只在P02位點上無差異，其他位點均有差異;DC040號樣品與對照樣品在P03和P08兩個位點上無差異，詳見表3。本次能力驗證的結(jié)果經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)機推廣中心判定為合格A等級，表明結(jié)果真確無誤。

6? ?結(jié)論與討論

目前，水稻品種真實性SSR標(biāo)記鑒定方法中最常用的3種方法分別為聚丙烯酰胺凝膠電泳、QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳和ABI熒光毛細(xì)管電泳[1，2]。

本研究分別用這3種方法檢測了本年度農(nóng)業(yè)農(nóng)村部分發(fā)的能力驗證樣品，每種方法都得到了清晰、便于分析的膠圖和峰圖，并將3種方法的結(jié)果進行了分析和比對，均得到了一致的檢測結(jié)果。但是3種方法因為原理不同，也存在本身的優(yōu)缺點：聚丙烯酰胺凝膠電泳成本低、結(jié)果直觀，但是操作復(fù)雜、耗時長、容易受到人為因素影響、通量也不高;QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳方法最簡便，但是分辨率略低;ABI熒光毛細(xì)管電泳分辨率高，最高可達1 bp，且通量高，但是成本相對較高，程序較復(fù)雜。

各個實驗室可以在工作中根據(jù)實際情況選擇合適的檢驗方法，也可以選擇幾種方法結(jié)合的方式進行試驗，如先用QIAGEN瓊脂糖毛細(xì)管電泳方法進行大量樣品的初篩，之后對問題品種用分辨率更高的其他兩種方法進行進一步鑒定，以獲得更加高效、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

參考文獻：

[ 1 ] 劉文彬，許理文，王鳳格，等.基于兩種熒光毛細(xì)管電泳平臺篩選評估玉米新型SSR 引物[J].玉米科學(xué)，2017，25（2）：24-30.

[ 2 ] 程本義，夏俊輝，龔俊義，等.SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測法在水稻DNA指紋鑒定中的應(yīng)用[J].中國水稻科學(xué)，2011，25（6）：672-676.

（收稿日期：2019-05-15）