李佳佳 鄭鵬 頓佳穎 高亞玲 甄麗娜 李春花

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定荊芥與連翹混合揮發(fā)油中β-蒎烯、胡薄荷酮含量的方法，并優(yōu)化其混合揮發(fā)油提取工藝。方法：采用氣相色譜法測(cè)定β-蒎烯、胡薄荷酮的含量，色譜柱為Hp-5毛細(xì)管色譜柱，檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器，程序升溫，進(jìn)樣量為0.5 μL，分流比為70 ∶ 1，載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測(cè)器溫度為280 ℃，空氣流速為390 mL/min，氫氣流速為36 mL/min，尾吹流速為15 mL/min，氮?dú)饬魉贋? mL/min。采用水蒸氣蒸餾法提取混合揮發(fā)油，以浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、加水量、連翹粉碎粒度為考察因素，以揮發(fā)油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量及其綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法結(jié)合信息熵法優(yōu)化混合揮發(fā)油的提取工藝。結(jié)果：β-蒎烯、胡薄荷酮檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為1.575～7.875 μg（r=0.999 9）、1.892～9.46 μg（r=0.999 7）；定量限分別為0.10、0.25 μg，檢測(cè)限分別為0.03、0.08 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%（n=6）；加樣回收率分別為97.77%～100.01%（RSD=0.93%，n=9）、96.47%～99.00%（RSD=0.89%，n=9）。優(yōu)化的提取工藝為浸泡2 h、提取6 h、加入10倍量水（mL/g）、連翹粒度半瓣。在此條件下，揮發(fā)油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量分別為 3.6 mL、1 450.4 mg、127.6 mg，RSD分別為1.62%、0.20%、1.42%。結(jié)論：所建含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 荊芥；連翹；混合揮發(fā)油；水蒸氣蒸餾法；正交試驗(yàn)；信息熵法；氣相色譜法；β-蒎烯；胡薄荷酮

Optimization of the Extraction Technology of Volatile Oil from Schizonepeta tenuifolia and Forsythia suspensa

LI Jiajia1，ZHENG Peng1，DUN Jiaying1，GAO Yaling2，ZHEN Lina3，LI Chunhua1（1. College of Pharmacy， Hebei College of TCM， Shijiazhuang 050200， China； 2. Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational and Technical College， Shijiazhuang 050026， China； 3. Dept. of Oncology， Hebei Provincial People’s Hospital， Shijiazhuang 050057， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of volatile oil of Schizonepeta tenuifolia and Forsythia suspensa， and to optimize the extraction technology of the volatile oil. METHODS： The contents of β-pinene and pulegone were determined by GC method. The determination was performed on Hp-5 capillary column. The detector was hydrogen flame ion detector with programmed temperature. The sample size was 0.5 μL， the split ratio was 70 ∶ 1， the carrier gas was nitrogen， the inlet temperature was 250 ℃， the detector temperature was 280 ℃， the air flow rate was 390 mL/min， the hydrogen flow rate was 36 mL/min， the tail flow rate was 15 mL/min， and the nitrogen flow rate was 1 mL/min. Based on single factor test， orthogonal test combined with information entropy method were used to optimize the extraction technology of S. tenuifolia and F. suspensa using soaking time， extraction time， material-liquid ratio and forsythia grain size as factors， with the extraction amount of volatile oil， the content of β-pinene and pulegone and their comprehensive score as indexes. RESULTS： The linear range of β-pinene and pulegone 1.575-7.875（r=0.999 9） and 1.892-9.46 μg（r=0.999 7）， respectively. The limits of quantitation were 0.10 and 0.25 μg； the limits of detection were 0.03 and 0.08 μg； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were less than 2% （n=6）； the recoveries were 97.77%-100.01% （RSD=0.93%，n=9） and 96.47%-99.00%（RSD=0.89%， n=9）. The optimal extraction technology was soaking 2 h， extracting for 6 h， 10-fold water （mL/g）， half a clove of granularity. Under this condition， the extraction amount of volatile oil， the contents of β-pinene and pulegone were 3.6 mL， 1 450.4 mg， 127.6 mg， respectively. RSD were 1.62%， 0.20%， 1.42%. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate and reproducible， and the optimal extraction technology is stable and feasible.

KEYWORDS Schizonepeta tenuifolia； Forsythia suspensa； Volatile oil； Steam distillation； Orthogonal test； Information entropy method； GC； β-pinene； Pulegone

羚羊感冒片是一種包衣片劑，具有清熱解毒之功效，對(duì)流行性感冒的治療具有顯著療效。該藥由羚羊角、牛蒡子、淡豆豉、金銀花、荊芥、連翹、淡竹葉、桔梗、薄荷素油、甘草等10味中藥材組成，其中荊芥與連翹的混合揮發(fā)油是其的主要藥效成分?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，荊芥揮發(fā)油為“辛”味成分，能行能散，上達(dá)皮膚表層，增強(qiáng)皮膚血液循環(huán)，增加汗腺分泌，有解熱作用[1-2]；連翹揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗炎、止痛作用[3]。胡薄荷酮為荊芥揮發(fā)油的主要成分，β-蒎烯為連翹揮發(fā)油的主要成分，因此兩者的含量可作為荊芥與連翹的混合揮發(fā)油質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[4-5]。

目前，對(duì)荊芥、連翹單味藥揮發(fā)油提取的研究已有報(bào)道[6-9]，常用連翹揮發(fā)油的提取方法為水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2萃取法，荊芥揮發(fā)油的提取方法為水蒸氣蒸餾法和微波輔助提取法，但尚未有荊芥與連翹混合揮發(fā)油提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究參考上述文獻(xiàn)采用水蒸氣蒸餾法提取荊芥與連翹的混合揮發(fā)油，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)建立了采用氣相色譜法測(cè)定荊芥與連翹混合揮發(fā)油的含量，旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890B型氣相色譜儀，包括SPH-300型氫氣發(fā)生器、SPB-3型全自動(dòng)空氣源（美國(guó)Agilent公司）；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；BSM1204型分析天平（上海卓精儀器有限公司）；LQ-A10002型電子天平（上海樂祺醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試劑

β-蒎烯對(duì)照品（批號(hào)：YN0418SA14，純度：99%）、胡薄荷酮對(duì)照品（批號(hào)：Z18D6H7858，純度：98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），無水硫酸鈉（分析純，深圳市中發(fā)源生物科技有限公司），無水乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

1.3 藥材

荊芥飲片（批號(hào)：18031801）、連翹飲片（批號(hào)：18022302）均購(gòu)于河北省保定市安國(guó)市場(chǎng)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院侯芳潔副教授鑒定分別為唇形科植物荊芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）的干燥地上部分、木犀科（Oleaceae）植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 氣譜條件 色譜柱：Hp-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢測(cè)器：氫火焰離子檢測(cè)器；程序升溫（升溫程序見表1）；進(jìn)樣量：0.5 μL；分流比：70 ∶ 1；載氣：氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；空氣流速：390 mL/min；氫氣流速：36 mL/min；尾吹流速：15 mL/min；氮?dú)饬魉伲? mL/min。

表1 升溫程序

Tab 1 Temperature programming

[溫度，℃＼&升溫速率，℃/min＼&保持時(shí)間，min＼& 80＼& 0＼&2＼&100＼& 2＼&0＼&200＼& 4＼&0＼&250＼&10＼&0＼&]

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-蒎烯對(duì)照品15.75 mg、胡薄荷酮對(duì)照品18.92 mg，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得β-蒎烯、胡薄荷酮質(zhì)量濃度分別為3.15、3.784 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密吸取上述各單一對(duì)照品溶液1 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 采用2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2204“水蒸氣蒸餾法甲法”提取揮發(fā)油[10]：精密稱取荊芥82 g、連翹164 g，置于3 000 mL圓底燒瓶中，加水1 968 mL，浸泡2 h，使用電熱套加熱4 h，提取荊芥與連翹的混合揮發(fā)油。收集混合揮發(fā)油，加無水硫酸鈉干燥，以3 000 r/min離心6 min，即得混合揮發(fā)油。取上述混合揮發(fā)油1.5 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液 按 “2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備缺荊芥、連翹的單一陰性樣品溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液、“2.1.4”項(xiàng)下陰性樣品溶液各適量，按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，理論板數(shù)以β-蒎烯峰計(jì)均大于3 000，分離度均大于1.5，拖尾因子（T）=0.98（0.95

2.1.6 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得β-蒎烯回歸方程為y=165 527.994 8x+70.969 0（r=0.999 9）、胡薄荷酮回歸方程為y=125 366.832 6x+37.119 5（r=0.999 7）。結(jié)果表明，β-蒎烯、胡薄荷酮進(jìn)樣量線性范圍分別為1.575～7.875 、1.892～9.46 μg。

2.1.7 定量限與檢測(cè)限考察 取“2.1.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，β-蒎烯、胡薄荷酮的定量限分別為0.10、0.25 μg，檢測(cè)限分別為0.03 、0.08 μg。

2.1.8 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，β-蒎烯、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為0.51%、1.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，β-蒎烯、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為1.93%、1.55%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品適量，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，β-蒎烯、胡薄荷酮的平均含量分別為542.15、40.08 mg，RSD分別為1.84%、1.79%（n=6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 按處方組成取已知含量的藥材樣品，共9份，分別加入一定量的單一對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.1.12 樣品含量測(cè)定 取藥材樣品適量，共9份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下氣譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，β-蒎烯含量范圍為762.7～1 430.3 mg，胡薄荷酮含量范圍為51.3～123.7 mg。

2.2 混合揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，確定以浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、加水量（C）、連翹粉碎粒度（D）為考察因素，以揮發(fā)油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量為指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝；每個(gè)因素取3個(gè)不同水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，并結(jié)合信息熵法確定各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。因素與水平見表3，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

2.2.2 信息熵法對(duì)數(shù)據(jù)的分析 參考相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣（Xij）mn和概率矩陣（Pij）mn（i指表4中的3個(gè)指標(biāo)，j指表4中的試驗(yàn)號(hào)，m指下列序列中的行數(shù)，n指下列序列中的列數(shù)）。

按以下公式計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)信息熵（Hi），得到各評(píng)價(jià)指標(biāo)的Hi：

Hi=-[[∑][i=1][n]PijInPij

Inn] Hi=[0.994 2 0.992 2 0.986 9]

再計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)（Wi）：Wi=[1-Hi

[∑][i=1][m]（1-Hi）] Wi=[0.218 6 0.291 1 0.490 4]，得揮發(fā)油提取量、β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.218 6、0.291 1、0.490 4。

對(duì)概率矩陣的數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)處理，得到綜合評(píng)分（綜合評(píng)分=Xi揮發(fā)油提取量/Xmax揮發(fā)油提取量×0.218 6+Xiβ-蒎烯含量/Xmaxβ-蒎烯含量×0.291 1+Xi胡薄荷酮含量/Xmax胡薄荷酮含量×0.490 4），再進(jìn)行方差分析，綜合評(píng)分結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表5 方差分析結(jié)果

Tab 5 Variance analysis results

[誤差來源＼&A＼&B＼&C＼&D＼&離均差平方和＼&0.05 ＼&0.08 ＼&0.04 ＼&0.00 ＼&自由度＼&2.00 ＼&2.00 ＼&2.00 ＼&2.00 ＼&均方差＼&0.03 ＼&0.04 ＼&0.02 ＼&0.00 ＼&F＼&29.20 ＼&48.65 ＼&25.80 ＼&1.00 ＼&P＼&<0.05＼&<0.05＼&<0.05＼&＼&]

注：F0.01（1，2）=99；F0.05（1，2）=19

Note：F0.01（1，2）=99；F0.05（1，2）=19

由方差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)揮發(fā)油提取量、 β-蒎烯含量、胡薄荷酮含量影響大小順序?yàn)锽>A>C>D，即提取時(shí)間>浸泡時(shí)間>加水量>連翹粉碎度；A、B、C對(duì)提取工藝均有顯著性差異，其中提取時(shí)間為最主要影響因素，得到最優(yōu)提取工藝為A2B2C3D3，即浸泡2 h、提取6 h、加入10 倍量水（mL/g）、連翹粒度半瓣。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述優(yōu)化后的提取工藝，平行操作3次，得揮發(fā)油提取量、β-蒎烯含量和胡薄荷酮含量分別為3.6 mL、1 450.4 mg、127.6 mg，RSD分別為1.62%、0.20%、1.42%，提示優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]，將進(jìn)樣口溫度確定為250 ℃，檢測(cè)器溫度確定為280 ℃，又根據(jù)β-蒎烯與胡薄荷酮的性質(zhì)，將升溫范圍確定為80～250 ℃。分流比可直接影響樣品的檢測(cè)情況，由于氣相色譜柱較細(xì)，樣品汽化后不可能瞬間全部進(jìn)入色譜柱，需要時(shí)間太長(zhǎng)，此外色譜帶中色譜峰較寬，需要及時(shí)分流部分樣品，若分流比過小，進(jìn)入色譜柱的樣品量多，組分間不易分離，峰形不好；分流比過大，進(jìn)入色譜柱的樣品量太少，靈敏度較差，故選擇分流比為70 ∶ 1。

羚羊感冒片組方中荊芥、連翹的揮發(fā)油成分具有較強(qiáng)的解表作用，為主要藥效成分。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荊芥與連翹的揮發(fā)油均為輕油，通過混合提取揮發(fā)油，不僅可以節(jié)省大量的時(shí)間與人力勞動(dòng)，還可以使二者的揮發(fā)油很好地融合，有利于下一步的制劑操作，因此本研究按處方比例以荊芥 ∶ 連翹=1 ∶ 2提取混合揮發(fā)油，以滿足實(shí)際生產(chǎn)的要求。

關(guān)于連翹揮發(fā)油的提取，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[2，9-10]，但均未對(duì)連翹的粒度進(jìn)行篩選。為提高揮發(fā)油提取量，本研究將連翹粒度分為過10目篩、半瓣及全粒3個(gè)等級(jí)，結(jié)果，連翹粒度為半瓣時(shí)提取的揮發(fā)油提取量最高，且出油速度較快。分析其原因可能為：藥材有效成分的溶出分為滲透和擴(kuò)散兩個(gè)階段；當(dāng)藥材粒度較小時(shí)，溶劑更容易滲入藥材顆粒內(nèi)部而加快有效成分的溶出；藥物粒度的大小會(huì)影響其有效成分?jǐn)U散的快慢，藥材粒度較小，擴(kuò)散面積增大、擴(kuò)散距離縮短，有利于有效成分的擴(kuò)散[17]。因此，粉碎后的連翹較未粉碎時(shí)，出油速度有所提升。但藥材粉碎過細(xì)，大量細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)一些高分子物質(zhì)溶于浸出液內(nèi)，導(dǎo)致浸出雜質(zhì)增多，溶液黏度增大，加之粉碎時(shí)間的增加，使粉碎機(jī)內(nèi)溫度升高，而致?lián)]發(fā)油在粉碎過程中損失，故連翹粒度為過10目篩時(shí)揮發(fā)油提取量較低。

綜上所述，所建含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，優(yōu)化所得提取工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2018-05-14 修回日期：2018-12-26）

（編輯：陳 宏）