王瑞君 謝蘭 馮娟 趙文龍 郭志方 喬連生 宋維芳

摘 要 目的：探討鐵皮石斛多糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）基因表達(dá)譜的影響。方法：以HUVEC為對象，采用MTS法檢測不同劑量鐵皮石斛多糖（50、100、200、400、800 μg/mL）對HUVEC細(xì)胞增殖活性的影響，并計算30%細(xì)胞生長抑制濃度（IC30）以篩選后續(xù)試驗劑量；采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測鐵皮石斛多糖作用24 h后HUVEC細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化情況，篩選差異表達(dá)基因；利用DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)前5位的基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析；以免疫相關(guān)差異表達(dá)基因為對象，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（qRT-PCR）對芯片檢測結(jié)果進行驗證。結(jié)果：經(jīng)100、200、400、800 μg/mL鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細(xì)胞的存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；IC30值為408 μg/mL。經(jīng)400 μg/mL（據(jù)IC30值確定）鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細(xì)胞中共有差異表達(dá)基因91個，其中表達(dá)上調(diào)的有84個、表達(dá)下調(diào)的有7個。上、下調(diào)表達(dá)差異前5位的基因分別為SELE、CCL2、CXCL6、IL8、ICAM1以及VWCE、CPT1A、CLU、CCL14、CINS4，主要與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等有關(guān)。HUVEC細(xì)胞中的差異表達(dá)基因主要分布于胞外區(qū)域，富集于細(xì)胞因子的產(chǎn)生及反應(yīng)、刺激反應(yīng)等生物學(xué)過程，發(fā)揮趨化因子及其受體活性等分子功能；其中上調(diào)表達(dá)基因SELE、ICAM1、CXCL2等主要富集于腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染等通路，下調(diào)表達(dá)基因CCL14主要富集于趨化因子信號通路。qRT-PCR驗證結(jié)果顯示，ICAM1基因的相對表達(dá)量顯著升高，CCL14基因的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05），與芯片檢測結(jié)果一致。結(jié)論：經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細(xì)胞共有91個基因表達(dá)差異明顯，且以表達(dá)上調(diào)為主。表達(dá)差異基因可能通過TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染等通路參與機體免疫調(diào)節(jié)。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛多糖；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；基因表達(dá)譜；免疫調(diào)節(jié)

Effects of Dendrobium officinale Polysaccharides on Gene Expression Profile of HUVEC

WANG Ruijun1，XIE Lan2，3，F(xiàn)ENG Juan2，3，ZHAO Wenlong2，3，GUO Zhifang2，3，QIAO Liansheng2，3，SONG Weifang1[1. Dept. of Pathophysiology， Fenyang College， Shanxi Medical University， Shanxi Fenyang 032200， China； 2. Medical System Biology Research Center， Tsinghua University School of Medicine， Beijing 100084， China； 3. National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology（CapitalBio）， Beijing 102206， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of Dendrobium officinale polysaccharides on gene expression profile of HUVEC. METHODS： HUVEC was selected as objects. MTS method was used to detect the effects of different doses of D. officinale polysaccharides （50， 100， 200， 400， 800 μg/mL） on the proliferation activity of HUVEC. The growth inhibitory concentration of 30% cells （IC30） was calculated to screen the dose of follow-up tests. cDNA microarray assay was used to detect the changes of gene expression profile for HUVEC after treated with D. officinale polysaccharides for 24 h， so as to screen differentially expressed genes. GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed for top 5 differentially expressed genes by using DAVID bioinformatics resource database. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to validate the results of microarray detection with immunity-related differentially expressed genes as objects. RESULTS： After treated with 100， 200， 400， 800 μg/mL D. officinale polysaccharides， survival rate of HUVEC were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC30 value was 408 μg/mL. After treated with 400 μg/mL （by IC30） D. officinale polysaccharides， there were 91 differentially expressed genes in HUVEC cells， of which 84 were up-regulated and 7 were down-regulated. Top 5 genes of up-regulated and down- regulated expression were SELE， CCL2， CXCL6， IL8， ICAM1 as well as VWCE， CPT1A， CLU， CCL14， CINS4， which may be mainly associated with immune conditions and inflammatory responses. The differentially expressed genes mainly distributed in extracellular domain， and were enriched in biological processes such as production and response of cytokines and stimulus response， and played molecular functions such as chemokine and its receptor activity. The up-regulated genes as SELE， ICAM1 and CXCL2 were mainly enriched in TNF signaling pathway， influenza A （H1N1）， herpes simplex virus infection and other pathways. The down-regulated gene CCL14 was mainly enriched in chemokine signaling pathway. Results of qRT-PCR validation tests showed that relative expression of ICAM1 was increased significantly， while that of CCL14 was decreased significantly （P<0.05）， which was in agreement with microarray detection results. CONCLUSIONS： After treated with D. officinale polysaccharides， the expression of 91 genes in HUVEC cells are different significantly， mainly being up-regulated. The differentially expressed genes may participate in immune regulation through TNF signaling pathway， influenza A （H1N1） and herpes simplex virus infection.

KEYWORDS Dendrobium officinale polysaccharides； HUVEC； Gene expression profile； Immune regulation

鐵皮石斛是蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥莖，是珍貴的藥用植物，素有“藥中黃金”之稱。據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）記載，鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱、明目強身等功效[1]。多糖是鐵皮石斛的主要活性成分之一，其不僅能改善免疫系統(tǒng)功能，而且還具有較好的抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性，同時在降糖方面也有一定的效果[2]。有研究表明，鐵皮石斛多糖可通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素6（IL-6）編碼基因的表達(dá)來激活機體免疫系統(tǒng)[3]，可通過調(diào)控腫瘤壞死因子（TNF）信號通路來抑制細(xì)胞凋亡[4]，同時還可通過核因子κB（NF-κB）通路來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[5]等。以往對鐵皮石斛多糖藥理作用的研究多局限于某一種疾病或某一條通路的數(shù)個基因，難以從基因?qū)用嫒媪私馄湔w作用機制，而基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展打破了這種局限。其中，基因表達(dá)譜芯片的應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)也相對成熟。該技術(shù)是將cDNA或者寡核苷酸探針固定在芯片上，通過與樣品中帶熒光分子標(biāo)記的mRNA雜交來檢測樣品中成千上萬個基因表達(dá)水平的變化情況，可高效、快速、高通量地分析相關(guān)生物學(xué)信息，從而實現(xiàn)對差異表達(dá)基因的大規(guī)模綜合分析[6]。本研究應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后免疫相關(guān)細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）基因表達(dá)譜的變化情況 ，全面分析差異表達(dá)基因，揭示鐵皮石斛多糖免疫調(diào)節(jié)作用的潛在靶點，以期為進一步研究其藥理作用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BJ-500A型粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；RE-52AA型旋蒸濃縮儀（上海亞榮生化儀器廠）；Plus384型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Molecular Devices公司）；Nanodrop-2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BioMixer Ⅱ型芯片雜交儀、LuxScanTM 10KA型芯片掃描儀（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司）；7900型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）。

1.2 藥材與試劑

鐵皮石斛飲片購自河北安國藥材市場，由安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司藥材檢驗室鑒定為蘭科植物鐵皮石斛（D. officinale Kimura et Migo）的干燥莖。

人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V2.0（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，批號：CP.409060）；Cy5-dCTP、Cy3-dCTP溶液（美國GE Healthcare公司，批號分別為9662845、9553232）；ECM培養(yǎng)基（美國ScienCell公司，批號：1001）；胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH為7.2～7.4）（美國HyClone公司，批號分別為150011、202904）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTS）試劑盒（美國Promega公司，批號：0000065769）；Trizol RNA抽提試劑盒（美國Life Technologies公司，批號：15596018）；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：303761）；DEPC水（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，批號：54100140）；SYBR Green Master Mix（美國Kapa Biosystems公司，批號：4928）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

HUVEC細(xì)胞購自美國ATCC公司。

2 方法

2.1 鐵皮石斛多糖的提取

取鐵皮石斛飲片適量，用粉碎機粉碎。取上述粉末適量，以水為溶劑按料液比1 ∶ 20（g/mL）回流提取2 h，提取液以4 000 r/min離心10 min后，取上清液，減壓濃縮至10 mL，加入乙醇40 mL（乙醇終濃度為80%），于4 ℃靜置24 h后，以4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀以 95%乙醇25 mL洗滌，以4 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，沉淀按上述條件重復(fù)處理1次，棄去上清液，沉淀經(jīng)干燥后，即得鐵皮石斛多糖，得率為30.8%（即鐵皮石斛多糖質(zhì)量與鐵皮石斛飲片粉末質(zhì)量的百分比）。將上述多糖溶于適量PBS中，制得質(zhì)量濃度為50 mg/mL（以多糖質(zhì)量計）的貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 鐵皮石斛多糖劑量的篩選

采用MTS法檢測鐵皮石斛多糖對HUVEC細(xì)胞增殖活性的影響，并以此篩選后續(xù)研究的劑量。將HUVEC細(xì)胞置于ECM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下（下同）培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞適量，以0.25%胰酶消化、傳代至所需量，再以0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，用ECM培養(yǎng)基重懸，得密度為1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后，將細(xì)胞隨機分為對照組和鐵皮石斛不同劑量組（50、100、200、400、800 μg/mL，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[7]），每組設(shè)置3個復(fù)孔。對照組加入PBS 1.6 μL，各給藥組分別加入“2.1”項下多糖貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μL（各組總體積均為100 μL），培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書加入MTS試劑，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處檢測每孔吸光度（A），并計算細(xì)胞存活率和30%細(xì)胞生長抑制濃度（IC30），細(xì)胞存活率=[（實驗組細(xì)胞平均A值-空白組細(xì)胞平均A值）/（對照組細(xì)胞平均A值-空白組細(xì)胞平均A值）]×100%（式中，“空白組”為不加細(xì)胞、不加藥的陰性對照）。上述試驗重復(fù)3次。

2.3 鐵皮石斛多糖對HUVEC細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響

2.3.1 HUVEC細(xì)胞總RNA的提取 取對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞，用ECM培養(yǎng)基重懸后，按6×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞隨機分為對照組和鐵皮石斛多糖組（400 μg/mL，劑量設(shè)置參考“2.2”項下IC30值），每組設(shè)置3個復(fù)孔。對照組加入PBS 8 μL，給藥組加入“2.1”項下多糖貯備液8 μL（各組總體積均為1 mL），培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，使用Trizol RNA抽提試劑盒并按照其說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，使用超微量分光光度計分別于230、260、280 nm處檢測各孔的A值（其中，A260 nm與核酸濃度相關(guān)，A280 nm與蛋白質(zhì)或氨基酸濃度相關(guān)，A230 nm與碳水化合物濃度相關(guān)），計算RNA的濃度（RNA濃度與A260 nm/A280 nm呈正比）。

2.3.2 探針標(biāo)記、芯片雜交與圖像采集、分析 取“2.3.1”項下各組細(xì)胞RNA適量，按照逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA試劑盒說明書進行擴增、轉(zhuǎn)錄后，得cDNA，以Cy5- dCTP、Cy3-dCTP溶液分別標(biāo)記對照組和給藥組，并設(shè)置熒光交換。將標(biāo)記好的探針等量混勻后，置于預(yù)雜交好的基因芯片上，放至芯片雜交儀中，于42 ℃雜交過夜，取出，用水清洗2次，每次5 min，晾干后，使用芯片掃描儀對基因芯片進行掃描，采用LuxScanTM v3.0圖像分析軟件分析標(biāo)記物Cy5、Cy3熒光強度，并對數(shù)據(jù)進行歸一化處理以校正系統(tǒng)誤差，將Cy3與Cy5熒光強度的比值（Ratio）大于2（上調(diào)）或小于0.5（下調(diào)）的基因判定為差異基因[8][基因名稱及其功能通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）予以確定]。

2.3.3 生物信息學(xué)分析 利用DAVID生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對“2.3.2”項所得差異基因進行GO富集分析，獲知其潛在作用靶點的功能分布（細(xì)胞部位、生物學(xué)過程、分子功能）；同法進行KEGG通路富集分析，獲知其潛在作用靶點的通路分布。GO和KEGG詞條的富集程度均以P表示，P值越小，表明其生物學(xué)富集途徑越顯著（P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

2.3.4 差異表達(dá)基因的驗證 分別取“2.3.1”項下兩組細(xì)胞RNA 1 μg，使用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，95 ℃變性5 min；嚴(yán)格按照其說明書操作）。引物設(shè)計采用Primer Premier 5.0軟件，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）體系（總體積10 μL）：cDNA（經(jīng)DEPC水稀釋10倍）3 μL，目的基因上、下游引物（5 μmol/L）各 1 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性3 s，60 ℃ 退火30 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因作為內(nèi)參，根據(jù)各組樣品熒光信號到達(dá)設(shè)定域值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），運用2-ΔΔCt法[9]計算兩組細(xì)胞差異表達(dá)基因的相對表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 劑量篩選結(jié)果

與對照組比較，100、200、400、800 μg/mL鐵皮石斛多糖組細(xì)胞存活率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。此外，鐵皮石斛多糖的IC30值為408 μg/mL，故最終選擇400 μg/mL的鐵皮石斛多糖進行后續(xù)試驗。

3.2 芯片雜交結(jié)果

經(jīng)400 μg/mL鐵皮石斛多糖作用24 h后，HUVEC細(xì)胞中存在表達(dá)差異的基因共91個，其中表達(dá)上調(diào)（Ratio>2）的有84個、表達(dá)下調(diào)（Ratio<0.5）的有7個，見圖1。將Ratio值由大到小進行排序，分別選取上調(diào)和下調(diào)表達(dá)差異前5位的基因（上調(diào)表達(dá)基因：SELE、CCL2、CXCL6、IL8、ICAM1，下調(diào)表達(dá)基因：VWCE、CPT1A、CLU、CCL14、GINS4），其基因名稱及功能見表2。

3.3 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

GO富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)基因多集中在胞外部分區(qū)域，且主要通過細(xì)胞因子的產(chǎn)生及反應(yīng)等生物學(xué)過程其發(fā)揮趨化因子受體等分子功能；下調(diào)表達(dá)基因主要集中在胞外區(qū)域，且主要通過刺激反應(yīng)等生物學(xué)過程來發(fā)揮趨化因子受體等分子功能，詳見圖2。

KEGG通路富集分析顯示，經(jīng)鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細(xì)胞上調(diào)表達(dá)基因主要富集于TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染、麻疹、趨化因子信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等通路上，包括SELE、CCL2、ICAM1、CXCL2、CXCL6等基因；而下調(diào)表達(dá)基因主要富集于趨化因子信號通路上，包括CCL14基因，詳見表3。

3.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

根據(jù)“3.3”項下結(jié)果，本研究從上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因中分別選取1個與免疫相關(guān)的代表性基因（即ICAM1、CCL14基因[10-11]）進行qRT-PCR驗證。ICAM1基因上游引物：5′-GTGGTCTGTTCCCTGGACG-3′，下游引物5′- GCACATTCACGGTCACCTC-3′；CCL14基因上游引物：5′-CCAAGCCCGGAATTGTCTTCA-3′，下游引物：5′-GGGTTGGTACAGACGGAATGG-3′；內(nèi)參基因上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，與對照組比較，400 μg/mL鐵皮石斛多糖組ICAM1基因的相對表達(dá)量顯著升高，CCL14基因的相對表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與芯片檢測結(jié)果一致，詳見表4。

4 討論

多糖是鐵皮石斛的主要成分之一，有研究表明鐵皮石斛多糖具有一定的免疫活性[12]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，鐵皮石斛多糖是一種可保護HUVEC細(xì)胞功能的藥物，在發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時，其可通過抑制炎癥因子的過表達(dá)來保護HUVEC細(xì)胞，對糖尿病血管病變的早期干預(yù)及保護具有一定的作用[13]。有研究從細(xì)胞水平探討了鐵皮石斛多糖對小鼠T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能、自然殺傷細(xì)胞活性以及巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響，發(fā)現(xiàn)其可明顯提高S180荷瘤小鼠的上述功能，具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[14]。上述研究對鐵皮石斛多糖的藥理研究多局限于某幾個基因或某幾條通路，難以從整體的角度全面觀察藥物的作用機制。基因表達(dá)譜芯片技術(shù)可高效、快速地對相關(guān)生物學(xué)信息進行高通量分析，進而從全基因組層面尋找差異表達(dá)基因，以便更為全面地匯總藥物潛在作用靶點的通路信息[6]。目前，利用基因芯片等高通量技術(shù)對鐵皮石斛多糖的免疫調(diào)節(jié)作用進行全面研究的相關(guān)文獻(xiàn)較少，且有關(guān)其作用于HUVEC細(xì)胞（HUVEC細(xì)胞能產(chǎn)生多種免疫因子，是機體發(fā)揮免疫功能的重要細(xì)胞[15]）的報道更為鮮見。為此，本研究通過MTS試驗篩選鐵皮石斛多糖的試驗劑量，并利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)探討了經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后HUVEC細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化情況。

結(jié)果顯示，經(jīng)100、200、400、800 μg/mL鐵皮石斛多糖作用24 h后，HUVEC細(xì)胞的存活率均較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示鐵皮石斛多糖對HUVEC細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。此外，鐵皮石斛多糖的IC30值為408 μg/mL，故將400 μg/mL作為后續(xù)研究的劑量。

基因芯片結(jié)果顯示，經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細(xì)胞中共有差異表達(dá)基因91個，其中表達(dá)上調(diào)的有84個、表達(dá)下調(diào)的有7個。Ratio值排序前5位的上調(diào)表達(dá)基因分別為SELE、CCL2、CXCL6、IL8、ICAM1，主要與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等有關(guān)；Ratio值排序前5位的下調(diào)表達(dá)基因分別為VWCE、CPT1A、CLU、CCL14、CINS4，主要與腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等有關(guān)。GO富集分析結(jié)果顯示，經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細(xì)胞的差異表達(dá)基因主要分布于胞外區(qū)域，通過細(xì)胞因子的產(chǎn)生及反應(yīng)、刺激反應(yīng)等生物學(xué)過程來發(fā)揮趨化因子及其受體活性等分子功能。這提示鐵皮石斛多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能與促進HUVEC細(xì)胞表面免疫相關(guān)趨化因子及其受體等的表達(dá)有關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，經(jīng)鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細(xì)胞上調(diào)表達(dá)基因主要富集于TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染、麻疹、趨化因子信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等通路上，可見SELE、CCL2、ICAM1、CXCL2、CXCL6等基因；而下調(diào)表達(dá)基因主要富集于趨化因子信號通路上，如CCL14基因。

結(jié)合GO富集分析和KEGG通路富集結(jié)果，本研究選擇與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)的代表性基因進行qRT-PCR驗證。其中，上調(diào)表達(dá)基因ICAM1編碼蛋白是免疫球蛋白超家族的成員之一，其表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)多種抗炎通路有關(guān)，上調(diào)ICAM1基因的表達(dá)可促進抗炎效果、修復(fù)機體炎癥損傷，是抗炎關(guān)鍵性分子之一[10]；此外，ICAM1介導(dǎo)的信號通路的激活可促進T細(xì)胞的生長與活化，并促進細(xì)胞因子的釋放，從而激活機體免疫系統(tǒng)、提高機體免疫力[16]。CCL14基因編碼蛋白又稱血漿過濾CC趨化因子，在免疫相關(guān)疾病中，可活化巨噬細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)，該基因表達(dá)的降低可抑制巨噬細(xì)胞的活化，并減輕機體炎癥反應(yīng)[11]。本研究采用qRT-PCR法對ICAM1、CCL14基因的表達(dá)情況進行了驗證。結(jié)果顯示，經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細(xì)胞中ICAM1基因的相對表達(dá)量較對照組顯著升高，CCL14基因的相對表達(dá)量較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與基因譜芯片檢測結(jié)果一致，進一步佐證了鐵皮石斛的免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用。

綜上所述，經(jīng)鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細(xì)胞共有91個基因表達(dá)差異明顯，且以表達(dá)上調(diào)為主；表達(dá)差異基因可能通過TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染等通路參與機體免疫調(diào)節(jié)。本研究通過分析鐵皮石斛多糖作用于HUVEC細(xì)胞后基因表達(dá)譜的變化以及差異表達(dá)基因的富集通路，可初步探索其在免疫調(diào)節(jié)過程中的分子機制，可為全面闡明其藥理作用機制提供參考。但是，目前關(guān)于上述基因與免疫相關(guān)疾病的研究有限，鐵皮石斛多糖如何通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來增強機體免疫功能尚有待深入研究；此外，上述潛在靶基因及富集通路仍有待在體研究進一步驗證。

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（收稿日期：2018-09-16 修回日期：2019-01-12）

（編輯：張元媛）