李萬平 何小蘇 陶磊 崔雪萍 高源 胡園 黃茜 巫秀美

中圖分類號 R743；R965.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）06-0752-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.06.07

摘 要 目的：觀察芬戈莫德對大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）損傷模型大鼠的改善作用。方法：將雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和芬戈莫德低、中、高劑量組（0.5、1、2 mg/kg），每組8只。除假手術組外其余各組大鼠均采用線栓法復制MCAO/R損傷模型。各給藥組大鼠均于再灌注后灌胃相應藥物[再灌注1 h（第1天）灌胃1次，再灌注22.5 h（第2天）灌胃1次，隨后每24 h灌胃1次，直至再灌注142.5 h（第7天）]；假手術組和模型組大鼠均灌胃等容生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。記錄各組大鼠的神經功能損傷評分、平衡木行走評分、記憶錯誤[工作記憶錯誤（WME）、參考記憶錯誤（RME）和總錯誤]次數(shù)，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測其血清炎癥細胞因子[白細胞介素6（IL-6）、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]含量，采用氯化三苯基四氮唑染色法檢測其腦梗死率。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經缺損評分（給藥第1～7天各時間點）、平衡木行走評分（給藥第2、4、7天）、記憶錯誤次數(shù)（給藥第2、4、7天）、血清炎癥細胞因子含量以及腦梗死率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德不同劑量組大鼠神經功能損傷評分（低劑量組給藥第3～7天各時間點，中、高劑量組給藥第2～7天各時間點），平衡木行走評分（低劑量組給藥第7天，中劑量組給藥第4、7天，高劑量組給藥第2、4、7天），RME和總錯誤次數(shù)（低劑量組給藥第4、7天，中、高劑量組給藥第2、4、7天），WME次數(shù)（各劑量組給藥第7天），血清L-6、IL-8、IL-10含量（各劑量組），血清TNF-α含量（中、高劑量組）以及腦梗死率（中、高劑量組）均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結論：芬戈莫德灌胃可顯著降低MCAO/R損傷模型大鼠的神經功能損傷評分和平衡木行走評分，并減少其記憶錯誤次數(shù)，具有一定的腦保護和記憶功能改善作用。上述作用可能與芬戈莫德下調IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的表達有關。

關鍵詞 芬戈莫德；大腦中動脈閉塞/再灌注損傷；神經功能損傷評分；平衡木行走評分；記憶功能；炎癥細胞因子；灌胃；大鼠

Study on Improvement Effects of Fingolimod on MCAO/R Injury Model Rats

LI Wanping1，2，HE Xiaosu1，2，TAO Lei1，2，CUI Xueping1，2，GAO Yuan1，2，HU Yuan1，2，HUANG Xi1，2，WU Xiumei1，2，3（1. Yunnan Provincial Key Lab of Entomological Biopharmaceutical R&D， Dali University， Yunnan Dali 671003， China； 2. National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics， Dali University， Yunnan Dali 671003， China； 3. Southwest China 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics and Arachnoidea Resource， Dali University， Yunnan Dali 671003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe improvement effects of fingolimod on middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） injury model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group and fingolimod low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.5， 1， 2 mg/kg）， with 8 rats in each group. Except for sham operation group， MCAO/R injury model was induced by suture-occluded method in other groups. Administration groups were given relevant medicine intragastrically after reperfusion [1 h after reperfusion （1st day）， 22.5 h after reperfusion （2nd day）， and then every 24 h until 142.5 h of reperfusion （7th day）]. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. The scores of neurological deficit and balance beam test， the times of memory error [work memory error （WME）， reference memory error （RME） and total error] were recorded in each group. The contents of serum inflammatory cytokines （IL-6， IL-8， IL-10， TNF-α） were determined by ELISA， and triphenyl tetrazolium chloride staining method was used to detect the rate of cerebral infarction. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit scores （at different time points of 1st-7th day after administration）， balance beam test scores （2nd， 4th， 7th day after administration）， times of memory error （2nd， 4th， 7th day after administration）， the contents of serum inflammatory cytokines and the rate of cerebral infarction were increased significantly in model group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， neurological deficit scores （low-dose group at different time points of 3rd-7th day， medium-dose and high-dose groups at different time points of 2nd-7th day after administration）， balance beam test scores （low-dose group at 7th day， medium-dose group at 4th and 7th day， high-dose group at 2nd， 4th， 7th day）， RME times and total error times （low-dose group at 4th and 7th day， medium-dose group and high-dose group at 2nd， 4th， 7th day after administration）， WME times （administrations groups at 7th day after administration）， serum contents of IL-6， IL-8 and IL-10 （administrations groups）， serum contents of TNF-α （medium-dose and high-does groups） and cerebral infarction rate （medium-dose and high-dose groups） were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Intragastric administration of fingolimod can significantly reduce neurological deficit score， balance beam test score and the times of memory error in MCAO/R injury model rats， and has a protective effect on cerebral tissue and memory function. These effects may be related to the down-regulation of inflammatory cytokines such as IL-6 and TNF-α by fingolimod.

KEYWORDS Fingomode； Middle cerebral artery occlusion/reperfusion injury； Neurological deficit score； Balance beam test score； Memory function； Inflammatory cytokines； Intragastric administration； Rats

腦缺血是危害人類健康的主要疾病之一，腦缺血/再灌注是一個復雜的病理生理過程，也是治療的關鍵步驟之一[1]。腦缺血發(fā)生后，機體通過介導白細胞黏附、浸潤于缺血處腦組織，從而引發(fā)炎癥反應，進而造成腦組織損傷[2]。芬戈莫德是從冬蟲夏草中分離的免疫相關成分多球殼菌素1（ISP-1）經化學修飾后所得的一種新型免疫抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)其除具有免疫抑制作用外，還對腦卒中以及神經功能損傷具有一定的改善作用[3]。Liesz A等[4]研究發(fā)現(xiàn)，芬戈莫德可減少大腦中動脈閉塞（MCAO）致腦損傷小鼠腦內侵襲性T、B淋巴細胞的數(shù)量，但對其梗死灶體積及行為障礙的改善不明顯；Nazari M等[5]以MCAO模型大鼠為對象，腹腔注射芬戈莫德0.5 mg/kg后發(fā)現(xiàn)，其梗死灶區(qū)域明顯縮小，且記憶功能障礙有所改善；陳志強等[6]綜述了口服芬戈莫德的藥動學特征，發(fā)現(xiàn)其在人體內的生物利用度可達93%?，F(xiàn)有實驗研究大多采用注射給藥方式，但該給藥方式具有一定的局限性。為此，本研究采用灌胃給藥方式，以局灶性腦缺血損傷模型大鼠為對象，初步評價了芬戈莫德的腦保護作用及其對大鼠記憶功能的改善作用，以期為臨床藥物新劑型的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

KL-UP-UV-20KNSY1059型艾柯超純水機（成都康寧實驗專用純水設備廠）；AE240型精密電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；TL-16R型臺式高速冷凍離心機（上海市離心機械研究所有限公司）；VOR72-X-5型渦旋機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；RM-200型八臂迷宮分析測試系統(tǒng)、BL-420型生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；SpectraMax M2型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；D90型數(shù)碼相機[尼康光學儀器（中國）有限公司]；梯形平衡木（80 cm×2.5 cm，實驗室自制）。

1.2 藥品與試劑

芬戈莫德原料藥（美國Sigma公司，批號：045M4713V，純度：98%）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（北京博奧拓達科技有限公司，批號：298-96-4）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，北京索萊寶科技有限公司，批號：531J021）；多聚甲醛、水合氯醛（天津市光復精細化工研究所，批號分別為21061011、20120827）；生理鹽水（貴州天地藥業(yè)有限責任公司，批號：G17042406）；白細胞介素6（IL-6）、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：04/2018）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級成年健康雄性SD大鼠，8周齡，體質量250～280 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產合格證號：SCXK（湘）2016-0002]。所有大鼠均于25 ℃室溫下喂養(yǎng)，并給予專用標準飼料、水，自由取食、飲水。本研究動物處置方法均符合動物實驗倫理學要求。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

挑選平衡木和八臂迷宮訓練合格[可在平衡木上自由行走；于八臂迷宮測試中參考記憶錯誤（RME）次數(shù)≤1且工作記憶錯誤（WME）次數(shù)=0]的大鼠40只，隨機分為5組，即假手術組、模型組以及芬戈莫德低、中、高劑量組（0.5、1、2 mg/kg，以生理鹽水為溶劑；劑量設置參考文獻[5]和本課題組前期研究結果），每組8只。參考相關文獻[7-8]采用線栓法復制大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）損傷模型。所有大鼠術前均禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，以仰臥位固定于恒溫加熱墊上（保持肛溫為37 ℃），頸部剃毛并進行常規(guī)消毒后，于頸正中偏左0.5 cm處切口（長度約1.5 cm），使用眼科鑷小心分離右頸總動脈（CCA）至分叉處，并向上分離頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），于CCA近心端打活結，于ECA處穿雙線，其中遠心端處的線打死結、近心端處的線（即固定線）打活結以固定線栓；與此同時，用動脈夾夾閉ICA，在ECA雙線之間剪一小口，從小口向ICA方向插入線栓，用固定線輕輕扎住線栓，松開動脈夾，繼續(xù)將線栓向頸內方向輕輕推入直至標記處[插入深度約為（18.0±0.5）mm]，扎緊固定線固定線栓，此時線栓頭端已通過大腦中動脈（MCA）起始處，進入較細的大腦前動脈（ACA），術后繼續(xù)保持大鼠體溫在37 ℃直至清醒，即實現(xiàn)了MCAO。記錄此時的缺血時間，然后縫合切口。缺血1.5 h后，將線栓向顱外方向輕輕拉出，遇到阻力時停止，此時線栓頭部已經脫出ACA和ICA，回到ECA插線口處，即實現(xiàn)了ACA再灌注。假手術組大鼠只分離CCA、ECA、ICA，除不插入線栓外，其余操作同上。各給藥組大鼠均于再灌注后灌胃相應藥物[再灌注1 h（第1天）灌胃1次，再灌注22.5 h（第2天）灌胃1次，隨后每24 h灌胃1次，直至再灌注142.5 h（第7天）]；假手術組和模型組大鼠均灌胃等容生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 神經功能損傷評分

分別于每天給藥后1 h時參照改良Longa評分法[7]對各組大鼠進行神經功能損傷評分。評分標準——0分：無神經功能損傷癥狀；1分：輕度損傷，即提尾懸空不能伸展左側前爪；2分：中度損傷，即行走向左側轉圈；3分：中重度損傷，即行走困難，并向左側傾倒；4分：重度損傷，即不能自發(fā)行走，意識水平下降。

2.3 平衡木行走評分

分別于給藥第2、4、7天對各組大鼠進行平衡木行走評分。將平衡木平放至距離地面高約100 cm處，其下方墊有厚度為10 cm的海綿墊（避免大鼠從平衡木上掉下受到傷害）。實驗前1周對各組大鼠進行訓練：每天早晚各訓練1次，每次10 min，使其能順利在平橫木上行走。造模與給藥后，分別于給藥第2、4、7天進行平衡木實驗，并參照相關文獻[9-11]制定六級評分標準對其進行平衡木行走評分。評分標準——0分：穿過平衡木，不會跌倒；1分：穿過平衡木，且跌到概率小于50%；2分：穿過平衡木，但跌倒概率大于50%；3分：能穿過平衡木，但癱瘓側后肢不能協(xié)助其向前移動；4分：不能穿過平衡木，但可坐在平衡木上；5分：將大鼠放在平衡木上會掉下來。

2.4 記憶功能評價

分別于給藥第2、4、7天對各組大鼠進行記憶功能評價。參照相關文獻[12-13]的八臂迷宮實驗方法，在臂遠端放置凹槽，分設食物臂（即凹槽內放置食物，其中1、2、4、7臂為食物臂）和無食物臂（即凹槽未放置無食物，其余4臂為無食物臂）。實驗前對各組大鼠進行相應訓練：將大鼠適當限食（使其體質量控制在自由攝食時的80%～85%），將其放于迷宮中央平臺內，開啟所有的小門，通過感應系統(tǒng)記錄大鼠在迷宮中的活動情況，包括大鼠進入各臂的次數(shù)、重復進入同一臂的次數(shù)，每天測試2次，連續(xù)4周，每次5 min。每只大鼠完成測試后，用乙醇清洗各臂及平臺以消除氣味對結果的影響。造模與給藥后，分別于給藥第2、4、7天統(tǒng)計各組大鼠5 min內的WME次數(shù)（即大鼠進入食物臂，從臂中出來后再次重復進入該臂的次數(shù)）、RME次數(shù)（即大鼠進入無食物臂的次數(shù)）和總錯誤次數(shù)（WME次數(shù)+RME次數(shù)）。

2.5 血清炎癥細胞因子檢測

給藥第7天，所有大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉，以一次性負壓采血管采血，室溫靜置1 h后，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，收集血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）以多功能酶標儀檢測各組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.6 腦梗死率檢測

采血后斷頭取腦，沿腦橋上界面切斷，去除嗅球，立即放入-20 ℃冰箱中，20 min后取出，由前向后作連續(xù)冠狀切片（厚度約為2 mm），共6片。將上述腦切片置入0.2%TTC溶液中，于37 ℃下避光染色20 min（梗死區(qū)域呈白色），取出，隨后放入4%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，取出，用數(shù)碼相機拍照，采用生物機能實驗系統(tǒng)計算各組大鼠腦梗死率（即梗死區(qū)域面積與大腦面積的百分比）

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著性差異（LSD）檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 芬戈莫德對MCAO/R損傷模型大鼠神經功能損傷評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠各時間點神經功能損傷評分均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德不同劑量組大鼠神經功能損傷評分（低劑量組給藥第3～7天，中、高劑量組給藥第2～7天）均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 芬戈莫德對MCAO/R損傷模型大鼠平衡木行走評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠各時間點平衡木行走評分均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德不同劑量組大鼠平衡木行走評分（低劑量組給藥第7天、中劑量組給藥第4、7天，高劑量組給藥第2、4、7天）均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 芬戈莫德對MCAO/R損傷模型大鼠記憶功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠各時間點RME、WME及總錯誤次數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德不同劑量組大鼠各時間點RME和總錯誤次數(shù)（低劑量組給藥第4、7天，中、高劑量組給藥第2、4、7天）、WME次數(shù)（各劑量組給藥第7天）均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

1

3.4 芬戈莫德對MCAO/R損傷模型大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德各劑量組血清大鼠IL-6、IL-8、IL-10含量以及芬戈莫德中、高劑量組大鼠血清TNF-α含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），詳見表4。

3.5 芬戈莫德對MCAO/R損傷模型大鼠腦梗死率的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，芬戈莫德中、高劑量組大鼠腦梗死率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

4 討論

腦缺血發(fā)生后的再灌注是神經功能恢復的基本條件，但也是加重腦組織損傷的重要因素，因此減輕再灌注損傷是腦缺血治療的首要目的[14]。目前，芬戈莫德治療腦缺血疾病的具體機制尚未闡明，其與臨床一線所用藥物的治療機制是否相同、類比是否合理皆有待商榷。因此，本研究在參考文獻[5]的基礎上，以神經功能損傷評分、平衡木行走評分、記憶錯誤次數(shù)、相關炎癥細胞因子含量及腦梗死率為指標，初步考察了芬戈莫德對MCAO/R損傷模型大鼠的腦保護作用，以及對其記憶功能的影響。

神經功能損傷評分和平衡木行走評分是較為經典的測評指標，可反映腦與肢體協(xié)調配合的能力；八臂迷宮實驗可區(qū)分短期的工作記憶和長期的參考記憶，被廣泛用于記憶功能的評價，且較Y迷宮、水迷宮等方法更為簡便、可行[13]?？紤]到本研究的實驗周期，以及減輕對實驗動物的傷害，本課題組在每天考察模型大鼠神經功能損傷評分的基礎上，僅對給藥第2、4、7天時的平衡木行走評分和記憶錯誤次數(shù)進行了考察。結果顯示，芬戈莫德不同劑量組大鼠神經功能損傷評分（低劑量組給藥第3～7天各時間點，中、高劑量組給藥第2～7天各時間點）、平衡木行走評分（低劑量組給藥第7天、中劑量組給藥第4、7天，高劑量組給藥第2、4、7天）、RME和總錯誤次數(shù)（低劑量組給藥第4、7天，中、高劑量組給藥第2、4、7天）、WME次數(shù)（各劑量組給藥第7天）均較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義。這提示芬戈莫德灌胃可明顯減輕MCAO/R損傷模型大鼠的神經功能損傷，提高其平衡能力，并減少其記憶錯誤次數(shù)，具有一定的腦保護作用和記憶功能改善作用。

腦缺血會加重缺血區(qū)域腦組織的損傷，這種病理生理調控的基礎是由TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子表達失控所導致的“炎癥瀑布效應”[15-16]。在腦缺血發(fā)生早期，TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因[17]，而IL-6則是急性缺血期腦損傷程度的評價指標之一[18]。腦缺血發(fā)生后，IL-8的表達會有所增加，同時其可調控TNF-α的分泌，促進其促炎作用的發(fā)揮，提示IL-8在中性粒細胞介導的炎癥損傷中具有樞紐作用，可成為腦缺血抗炎治療研究的新靶標[19]。IL-10作為一種多效抗炎因子，對TNF-α等前炎癥細胞因子的表達具有一定的調控作用[20]。本研究結果表明，芬戈莫德各劑量組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10含量以及芬戈莫德中、高劑量組大鼠血清TNF-α含量均較模型組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義。這提示芬戈莫德可抑制MCAO/R損傷模型大鼠相關炎癥細胞因子的分泌與表達，其可能是芬戈莫德神經保護作用的機制之一。

綜上所述，芬戈莫德灌胃可顯著降低MCAO/R損傷模型大鼠的神經功能損傷評分和平衡木行走評分，并減少其記憶錯誤次數(shù)，具有一定的腦保護和記憶功能改善作用。上述作用可能與芬戈莫德下調IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的表達有關。本研究可為芬戈莫德臨床治療腦缺血性疾病提供理論和實驗基礎，但具體機制仍有待后續(xù)研究予以完善。

（致謝：大理大學昆蟲生物醫(yī)藥研究院藥理藥效學研究平臺提供條件完成此實驗）

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（收稿日期：2018-09-03 修回日期：2019-01-10）

（編輯：張元媛）