潘傳燕 馮鵬霏 張永德 羅洪林

摘要：[目的]為研究尼羅羅非魚過氧化物酶體增殖物激活受體δ（PPARδ）的表達(dá)情況，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPARδ，純化重組蛋白并獲得多克隆抗體。[方法]對PPARδ進(jìn)行生物信息學(xué)分析后設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增PPARδ，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-B2m中，構(gòu)建重組表達(dá)載體;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)人大腸桿菌B21并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物。用鎳柱純化重組蛋白后免疫日本大耳兔制備多克隆抗體，用間接ELISA技術(shù)檢測抗體效價，WesternBlot鑒定抗體的特異性。[結(jié)果]成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-B2m-PPAR8，實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的原核表達(dá)和純化，重組蛋白以包涵體蛋白和可溶性蛋白2種形式存在，分子量約為90kD;制備的多克隆抗體效價為1：2048000，WesternBlot檢測結(jié)果表明該抗體能特異性識別尼羅羅非魚PPARδ。[結(jié)論]成功實(shí)現(xiàn)了尼羅羅非魚PPARδ重組蛋白的融合表達(dá)，在大腸桿菌中高效表達(dá)后純化重組蛋白，免疫日本大耳兔獲得了效價高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體。為尼羅羅非魚PPARδ的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：尼羅羅非魚;PPARδ;原核表達(dá);多克隆抗體

中圖分類號：S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）09-1053-06

0引言

（研究意義）羅非魚具有生長快、食性雜、耐低氧、個體大、產(chǎn)量高和肥滿度高等多種優(yōu)良的養(yǎng)殖性狀，是世界各國養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛的品種之一，也是我國重要的養(yǎng)殖品種之一.近年來，脂肪含量作為影響魚肉品質(zhì)的一項重要因素受到了越來越多的關(guān)注，而過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs）在調(diào)控脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝中起著重要作用，研究魚類PPARs的功能及其作用機(jī)制，有利于提高魚類肉質(zhì)。因此，開展尼羅羅非魚PPARs表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制等相關(guān)研究具有重要意義。（前人研究進(jìn)展）過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是核激素受體家族中的配體激活受體，是英國科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)的，具有調(diào)控脂質(zhì)代謝、脂肪細(xì)胞增殖分化、胰島素敏感、炎癥反應(yīng)等功能。有PPARα、PPARδ和PPARγ等3種亞型，在靈長類、嚙齒類、兩棲類、鳥類和部分水產(chǎn)動物中，這3種亞型已經(jīng)被成功克隆和鑒定。其中，PPARα基因通過調(diào)控脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)，在脂肪細(xì)胞的分化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪酸氧化等方面發(fā)揮重要作用;PPARγ是最具脂肪組織特異性的PPARs成員，PPARγ的生物學(xué)功能主要有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制細(xì)胞凋亡、緩解炎癥反應(yīng)等;PPARδ參與皮膚和腦的發(fā)育、骨的形成、肥大細(xì)胞免疫以及腫瘤的發(fā)生等多種生物學(xué)過程，也參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。PPARδ基因總長約35kb，有6個功能結(jié)構(gòu)域，N端是配體非依賴的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域保守性差;中間區(qū)域高度保守，為DNA結(jié)合域（DBD），含一個α螺旋的DNA結(jié)合基序和2個鋅指結(jié)構(gòu);C端是配體結(jié)合域（LBD），比PPARa和PPARγ的配體結(jié)合域小，是一個可以與多種酸性親脂化合物結(jié)合的袋裝結(jié)構(gòu)，PPARδ因其配體的特異性而具有特異的生理功能。PPARδ在動物各組織中均表達(dá)，在脂質(zhì)代謝活躍的組織中表達(dá)水平較高，如脂肪組織、心臟、骨骼肌等部位，在脾、肺、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等也有表達(dá)。目前關(guān)于魚類PPARs的研究較多，已在黃顙魚、卵形鯧鰺、大黃魚和虹鱒等多種魚類中開展PPARs基因克隆和功能研究，但魚類PPARδ的研究較少且主要集中在脂質(zhì)代謝上。（本研究切入點(diǎn)）目前尚未見尼羅羅非魚PPARδ的相關(guān)報道，尼羅羅非魚PPARδ的功能和作用機(jī)制尚不清楚。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究通過構(gòu)建尼羅羅非魚PPARδ原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPARδ重組蛋白，分析重組蛋白的表達(dá)情況，并將純化后的重組蛋白免疫日本大耳兔，制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚PPARδ的功能及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

參照潘傳燕等前期研究中的材料制備方法。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)方法主要參照潘傳燕等的方法。

1.2.1PPARδ蛋白結(jié)構(gòu)分析和抗原預(yù)測 PPARδ蛋白質(zhì)疏水性用ExPASy中的ProtScale模塊（https：//web.expasy.org/protscalc/）進(jìn)行分析，蛋白序列的跨膜區(qū)間用TMHMM server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行預(yù)測。使用DNAstar軟件的Protean模塊預(yù)測蛋白的親水性、抗原指數(shù)等參數(shù)。

1.2.2PPARδ基因擴(kuò)增及原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)尼羅羅非魚PPARδ基因序列（NCBI No.NP 001276-565.1）設(shè)計特異性引物，引物設(shè)計軟件為PrimerPremier 5.0，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為：PPARS-F：5'-TCCACTGGGT-TCTCGGACTATGGATGGTTTTCAGCA，PPARS-R：5'-TAAGGCCGCACTCGAGCACCACATACATATC-TTTATAGAT-3’。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃4min;94℃45s，52℃45s，72℃45s，28個循環(huán);72℃10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，之后進(jìn)行切膠回收。

用SalΙ與BamHΙ對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理后，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-B2m，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-B2m-PPARδ，轉(zhuǎn)至大腸桿菌B21中培養(yǎng)，挑選陽性克隆，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成測序鑒定。

1.2.3重組蛋白的表達(dá)和純化 將重組質(zhì)粒（pET-B2m-PPARδ）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B21中，在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基已提前加入100g.mL的氨芐青霉素（Amp），培養(yǎng)溫度為37℃，當(dāng)OD為0.6后，將培養(yǎng)溫度降為30℃;此時加入異丙基-B-D硫代半乳糖苷（IP7G），IPTG的終濃度為0.5mmol·L，30℃條件下培養(yǎng)180min。然后收集菌液，離心收集菌體并用超聲破碎，4℃20000g離心0.5h，收集上清液和沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

利用Ni-NTA樹脂層析柱純化重組蛋白，收集菌體，用10倍柱床體積的NTABuffer沖洗，流速控制在1mL·min左右，收集洗脫液。用紫外吸收法檢測純化后的蛋白濃度，并用SDS-PAGE電泳檢測純化后的重組蛋白。

1.2.4多克隆抗體制備和效價檢測 PPARδ多克隆抗體的多肽序列如下：MDGFQQTAPEKHDGVNGYCEPNSPQDAADVRWTPPQAESVGSDSCGATSVSEVADLKELKRRESEDEEEKEEKEEKEGVPASKYPKRDQKKRRKEGEDQENSDNKQNSSASSSYTDLSHTSSPSLSEQLRLGREDSTSSGISVECKVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTVRMKLEYERCERSCKIQKKNRNKCQYCRFQKCLSLGMSHDAIRYGRMPEAERKKLVAGILAEELNVSKPGGSDLKTLAKQVNTAYQKNLSMTKKRARSILMGKTSSTSPFVIYDVDTLWKAESGLVWSQLTPGAPLTKEIGVHVFYRCQCTTVETVRELTEFAKCIPGFVDLFLNDQVTLLKYGVHEAIFAmLPSLMNKDGLLVANGKGFVTREFLRSLRKPFSEIMEPKFEFAVKFNALELDDSDLALFVAAIILCGDRPGLMNVKQVEQSQDNILQALDLHLQANHSDSAYLFPKLLQKMADLRQLVTENAQLVQKIKKTESETSLHPLLQEIYKDMY。

試驗(yàn)用日本大耳兔2只（編號為G479、G480），耳靜脈采集免疫前血清做陰性對照。將純化后的重組蛋白與弗氏完全佐劑按1：1的容積比混合，皮下多點(diǎn)注射日本大耳兔，注射劑量為500ug·只。每只兔子最少免疫4次，每次免疫間隔2周，每次免疫1周后耳靜脈采集免疫血清，用間接ELISA法檢測抗體的效價。

重組PPARδ蛋白在96孔板中完成抗原包被，蛋白濃度為2ug·mL，加樣量為100uL·孔，置于4℃過夜，以免疫前血清作陰性對照，待檢樣品按1：2000、1：4000作梯度稀釋至1：32768000，將稀釋液作為一抗加入到96孔板中;以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗。用TMB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色液用量為100pL·孔，顯色時間為20min，加入50uL HSO終止顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測OD值，產(chǎn)生陽性反應(yīng)的最大稀釋度即為抗體的效價。

1.2.5抗體特異性的Western blotting分析 以免疫前血清為對照，取25、10ng純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）上，放置1h后用PBST緩沖液洗滌3次，每次5min，于封閉液中37℃封閉2h，封閉液是1%的酪蛋白。以制備的兔抗血清1：1000倍稀釋液為一抗，在37℃孵育60min;洗滌后再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗檢測多克隆抗體的特異性。

1.2.6抗體純化

采用Protein G親和層析柱對PPAR5多抗進(jìn)行純化，操作步驟詳見張永德等的方法，將抗血清與2×PBS緩沖液按1：1混合，經(jīng)10倍柱體積以上的PBS洗滌，直至流出液無蛋白檢出，加入2倍柱體積0.1mol'L檸檬酸（pH2.7）洗脫，收集洗脫產(chǎn)物，SDS-PAGE電泳檢測純化后的多抗。

2結(jié)果與分析

2.1 跨膜區(qū)和抗原性分析

PPARδ蛋白的跨膜區(qū)、表面可及性、親疏水性等參數(shù)的分析結(jié)果（圖1）顯示，PPARδ蛋白編碼512個氨基酸，1個跨膜區(qū)，270-287為跨膜區(qū)，該段區(qū)域疏水性較強(qiáng);無信號肽序列，局部親水性較好，全長蛋白抗原指數(shù)得分適中，進(jìn)行全長表達(dá)，可以引起良好的免疫。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將雙酶切載體和目的基因連接酶切所需片段，酶切位點(diǎn)為SaI和BamHI，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B21培養(yǎng)后挑斑鑒定，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，目的條帶大小為1536bp（圖2），與預(yù)期大小一致。測序結(jié)果顯示：目標(biāo)序列100%正確，證實(shí)PPARδ基因已正確插入載體pET-B2m中，表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

通過誘導(dǎo)劑對重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5mmol·L，30℃誘導(dǎo)3h，PPARδ得到較高水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，上清液與沉淀在90kD處都出現(xiàn)了清晰的蛋白條帶（圖3），上清液和沉淀的蛋白條帶粗細(xì)相當(dāng)，說明上清液和沉淀中的目的蛋白含量接近（圖3），表明表達(dá)的融合蛋白有兩種存在形式，即可溶性蛋白和包涵體蛋白。SDS-PAGE鑒定純化后的重組蛋白，結(jié)果顯示在90kD處有一條清晰的蛋白條帶（圖4），純化后PPARδ蛋白量占總蛋白量的85%，質(zhì)量濃度達(dá)1.5mg.mL，是適合免疫日本大耳兔的抗原。

2.4多克隆抗體的效價測定

以免疫前血清作為陰性對照，免疫一周后，耳靜脈采血并分離血清，用間接ELISA法檢測多抗的效價。結(jié)果表明，多克隆抗體的效價為1：2048000，抗體效價高。

2.5抗體特異性檢測結(jié)果

利用蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測抗體的特異性，結(jié)果表明：SDS-PAGE在約90kD處檢測到清晰條帶，且無雜帶（圖5），25ng重組蛋白的蛋白條帶較10ng的蛋白條帶粗，而陰性對照無特異性條帶，多克隆抗體能特異性地結(jié)合尼羅羅非魚PPARδ表達(dá)蛋白。

2.6抗體純化結(jié)果

收集的抗血清經(jīng)純化后，純度達(dá)85%以上，質(zhì)量濃度為10mg.mL。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，在約50、25ku處有清晰的條帶（圖6），表明抗體純化效果良好。

3討論

本研究通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了尼羅羅非魚PPARδ蛋白，該蛋白編碼512個氨基酸，重組蛋白有2種表達(dá)形式，即包涵體蛋白和可溶性蛋白;純化的重組蛋白免疫日本大耳兔后獲得了效價高特異性好的多克隆抗體。錢云霞等表達(dá)了鱸PPAR？基因，其融合蛋白主要以包涵體蛋白存在，制備了效價達(dá)1：16000的多克隆抗體。關(guān)于魚類PPARs的研究主要集中在基因克隆和組織表達(dá)，且PPARα和PPARγ的研究較多，而PPARδ的研究較少.Cho等克隆并分析了牙鲆PPARγ基因，cDNA全長1667bp，編碼532個氨基酸，在饑餓條件下其表達(dá)增加。賈成霞等發(fā)現(xiàn)虹鱒PPARα在腹部肌肉、腸、腎臟等脂肪含量較高的組織中表達(dá)較高。高俊等克隆了刀鱭PPARγ基因并研究了PPARγ應(yīng)激應(yīng)答，刀鱭PPARγ的cDNA全長1951bp，ORF為1470bp，預(yù)測編碼489個氨基酸。Zhao等指出，PPARα在團(tuán)頭魴精卵巢中表達(dá)，精巢支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的PPARs可能直接參與生殖細(xì)胞的成熟。陳亮等克隆了草魚PPARδ基因并比較了其在不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，草魚PPARδ基因cDNA核心序列片段大小為604bp，編碼201個氨基酸，在肝臟、肌肉和心臟的表達(dá)水平較高。錢倫從大黃魚肝臟中克隆了PPARδ全長eDNA，序列長3390bp，編碼510氨基酸，在脾、腎、肝、鰓等多個組織均表達(dá)，在肝臟中表達(dá)量最高。尼羅羅非魚PPARδ的原核表達(dá)和多克隆抗體制備尚未見相關(guān)報道。

多克隆抗體是由多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的，受到多種抗原決定簇刺激并可與多種抗原表位結(jié)合的抗體，存在于免疫動物的血清中。可通過直接分離血清獲得。多克隆抗體制備過程較簡單，用抗原免疫動物即可，經(jīng)過3至4次免疫，ELISA檢測抗血清效價，收集抗血清，純化后即可獲得多克隆抗體。效價高、特異性良好的抗體為基因表達(dá)和基因功能研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。多克隆抗體具有制備快速、技術(shù)簡單、穩(wěn)定性良好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多個科研和生產(chǎn)領(lǐng)域。張曼等克隆并表達(dá)了錦鯉皰疹病毒ORFl基因，制備了多克隆抗體;李素一等制備了抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗體。本研究獲得的多克隆抗體效價達(dá)1：2048000，錢云霞等制備的鱸PPARγ多克隆抗體效價僅為1：16000。尼羅羅非魚PPARδ多克隆抗體能特異性的識別尼羅羅非魚PPARδ蛋白，說明該抗體具有良好的免疫學(xué)活性，為研究尼羅羅非魚PPARδ的生物學(xué)特性和功能提供了分子工具。

生物信息學(xué)分析是開展基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)，它從核酸和蛋白質(zhì)序列出發(fā)，分析序列中表達(dá)的結(jié)構(gòu)功能的生物信息。本研究在制備多克隆抗體之前，對尼羅羅非魚PPARδ進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。PPARδ基因，結(jié)構(gòu)上高度保守，編碼512個氨基酸，1跨膜區(qū)，無信號肽序列，局部親水性好，抗原表位較好，可用于多抗制備。本研究制備的多抗效價高、特異性好，獲得的重組蛋白和多克隆抗體為進(jìn)一步探究尼羅羅非魚PPARδ的功能和作用機(jī)制提供了分子工具。