蘇鳳哲　劉曉　于文濤

摘要 目的：觀察補腎通絡方對肺纖維化大鼠肺組織結(jié)締組織生長因子（CTGF）表達的影響。方法：采用博來霉素誘導建立實驗性肺纖維化大鼠模型，以氫化可的松琥珀酸鈉為對照，觀察補腎通絡方對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)、血清羥脯氨酸（HYP）、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）及肺組織CTGF和CTGFmRNA表達的影響。結(jié)果：同正常組比較，模型組大鼠肺組織病理纖維化顯著，炎性反應明顯，同時伴有血清HYP，HA，LN升高（P<0.05或P<0.01），肺組織CTGF和CTGFmRNA表達升高（P<0.05或P<0.01）。同模型組比較，補腎通絡高劑量組大鼠血清HYP，HA，LN含量明顯下降（P<0.05）;補腎通絡低劑量組LN含量明顯下降（P<0.01），氫化可的松琥鉑酸鈉對照組HYP、HA、LN含量明顯下降（P<0.05或P<0.01），補腎通絡方高劑量組和氫化可的松琥珀酸鈉對照組大鼠肺組織CTGF和CTGFmRNA表達明顯下降（P<0.05或P<0.01），肺組織病理形態(tài)的改善。結(jié)論：補腎通絡方可能通過從蛋白和基因水平調(diào)節(jié)實驗性肺纖維化大鼠肺組織CTGF表達，抑制肺纖維化。

關鍵詞 補腎通絡方;肺纖維化;羥脯胺酸;透明質(zhì)酸;層粘連蛋白;結(jié)締組織生長因子;基因調(diào)節(jié);實驗研究

Effect of Bushen Tongluo Prescription on the Expression of Connective Tissue Growth Factor in Pulmonary Fibrosis Rats

Su Fengzhe1，Liu Xiao2，Yu Wentao2

（1 Beijing Tongzhou District of Beijing Combine Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Beijing 101100，China; 2 Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Bushen Tongluo prescription on the expression of Connective tissue growth factor（CTGF）in pulmonary tissue in rats with pulmonary fibrosis.Methods：An experimental model of pulmonary fibrosis was made by bleomycin induction，and compared with hydrocortisone sodium pine succinate，the effects of Bushen Tongluo prescription on pulmonary Histopathology，serum hydroxyproline（HYP），hyaluronic acid（HA）and laminin（LN）and the expression of CTGF and CTGFmRNA in lung tissue were observed in pulmonary fibrosis rats.Results：Compared with the normal group，the model group showed significant pathological fibrosis，accompanied by elevating HYP，HA and LN of serum（P<0.05 or P<0.01）and inflammatory response，and accompanied by elevating the expression of CTGF and CTGFmRNA in the lung（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the model group，the expression of CTGF and CTGFmRNA decreased significantly in the high dose group and the hydrogenated sodium matesartesperate control group（P<0.05 or P<0.01），and pathological morphology of lung tissue were improved.Conclusion：It is possible to inhibit pulmonary fibrosis by regulating the expression of CTGF and CTGFmRNA in experimental pulmonary fibrosis rats.from protein and Gene levels.

Key Words Bushen Tongluo Prescription;Pulmonary fibrosis;Hydroxyprolic acid;Hyaluronic acid;Laminin;CTGF;Gene regulation;Experimental research

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.013

肺間質(zhì)纖維化以大量的成纖維細胞聚集、細胞外基質(zhì)沉積并伴有炎性損傷為特征的病變，是多種肺損傷性疾病發(fā)展到晚期的常見病理結(jié)局，其進展快，預后差，中位生存期僅2.8年[1]。由于環(huán)境污染、人口老齡化等因素，近年來本病的發(fā)病率明顯上升。補腎通絡方為全國首批中醫(yī)優(yōu)秀臨床人才蘇鳳哲教授治療肺纖維化的臨床經(jīng)驗方，經(jīng)過多年臨床應用，療效顯著，并已獲得國家發(fā)明專利（專利號：201510683592.6）。本研究從分子水平揭示該方藥調(diào)節(jié)肺組織結(jié)締組織生長因子（CTGF）表達，抑制肺纖維的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)重180～200 g、由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證編號：1705308。普通實驗室飼養(yǎng)環(huán)境，恒溫、恒濕，自由飲食。

1.1.2 藥物 補腎通絡方：西洋參10 g、蟲草花12 g、蛤蚧5 g、浙貝母12 g、白僵蠶12 g、全蝎8 g、桃仁10 g、穿山甲8 g，具有補腎化痰、活血通絡的作用，飲片購自河北樂仁堂藥，使用前加蒸餾水煎至所需濃度，分別裝瓶，冰箱儲存?zhèn)溆谩浠傻乃社晁徕c（常州四藥制藥有限公司，生產(chǎn)批號：201609502）。注射用鹽酸博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號：16023511）。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：Masson kit（珠海貝索生物技術有限公司，批號：BA-4079A）;HYP kit（南京建成生物工程研究所，批號：A030-2）;HA kit（天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司，批號：RHC1711）;LN kit（天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司，批號：RHC1711）;CTGF antibody（GeneTex Inc，GTX124232）;GAPDH antibody（Santa Cruz Biotechnology，Inc，批號：sc-25778）;DEPC（Sigma，批號：D5758）;E.Z.N.A.Total RNA kit II（OMEGA bio-tek，批號：R6934），cDNA Synthesis kit（TaKaRa，批號：6210A）;SYBR Green熒光定量PCR kit（TIANGEN，批號：FP205）;其他國產(chǎn)試劑均為分析純試劑。儀器：恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司，型號：SHA-B）、高性能無菌實驗臺（哈爾濱東聯(lián)，型號：DL-CJ-1N）、紫外透射儀（北京鼎國，型號：UV-254）、高速冷凍離心機（美國Sigma，型號：1-15K）、超低溫保存箱（日本三洋，型號：MDF-382E）、紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司，型號：756MC）、凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司，型號：UVP）、分析軟件Quantity one（Bio-Rad Technical Service Department）、復日生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復日科技有限公司，型號：FR-980）、水平電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYY）、實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司，型號：7500 fast）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 適應性喂養(yǎng)一周后，將48只大鼠隨機分為正常組8只和模型組、補腎通絡高劑量組、補腎通絡低劑量組、氫化可的松琥鉑酸鈉對照組各10只。除正常組外，其余各組大鼠參加造模，造模方法參考文獻[2]，采用博萊霉素誘導制作肺纖維化大鼠模型。大鼠術前禁食24 h，乙醚麻醉后，小鼠仰臥于固定臺上，固定頭和四肢，乙醇消毒后，剝離頸部軟組織，暴露氣管，用1 mL藍芯針管向氣管內(nèi)緩慢推注0.4%博萊霉素5 mg/kg（0.25 mL/kg），正常組注入生理鹽水0.25 mL，注藥后立即旋轉(zhuǎn)動物，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，逐層縫合。

1.2.2 給藥方法 在造模術后第3天，補腎通絡高劑量組灌服1.42 g/mL的補腎通絡方藥液10 mL/kg（相當于14.2 mL/kg體質(zhì)重），補腎通絡低劑量組灌服濃度為0.71 g/mL補腎通絡方藥液10 mL/kg（相當于7.1 mL/kg體質(zhì)重），氫化可的松琥鉑酸鈉對照組腹腔注射濃度為0.458 g/mL的氫化可的松琥珀酸鈉10 mL/kg（相當于4.58 mg/kg體質(zhì)重），正常組、模型組灌胃等體積的生理鹽水，共治療28 d。治療結(jié)束后，剔除死亡大鼠，每組8只納入統(tǒng)計。

1.2.3 檢測指標及方法

1.2.3.1 纖維化指標檢測 實驗大鼠最后一次灌胃后禁食24 h，將其分別斷頭取血3 mL，3 500 r/min 4 ℃下離心15 min，分離血清并置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存待測。采用RIA法檢測各組大鼠肺組織羥脯氨酸（HYP）、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）含量。

1.2.3.2 Western blot檢測 采用Western blot檢測CTGF表達，每組取5份樣本納入統(tǒng)計。取大約500 mg肺組織加1 mL提取液勻漿提取，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清，加入等體積2χSDS上樣緩沖液，100 ℃中煮沸5 min。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣等量總蛋白。利用水浴式電印跡法將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上。室溫振蕩封閉膜2 h后，加入1∶250（封閉液稀釋）的第一抗體，室溫緩慢搖動2 h，用PBS-Tween洗膜3次后，再加入1∶5 000（封閉液稀釋）的HRP標記的第二抗體，室溫振搖1 h，PBS-Tween充分洗膜后，將膜浸入DAB顯色液中，室溫充分顯色后，立即用蒸餾水洗膜，然后將膜轉(zhuǎn)入PBS中觀察、照相、分析。

1.2.3.3 RT-qPCR檢測 采用RT-qPCR檢測CTGFmRNA表達。取肺組織30 mg、研磨并加入1 mL RNA-Solv Reagent混合均勻，加入200 μL氯仿，離心15 min，提取上層RNA溶解物，加入等體積的異丙醇，充分混勻，4 ℃離心10 min。小心棄上清，加入預冷的75%的乙醇。4 ℃反復離心2次，用20 μL RNase DH20溶解沉淀，保存在-80 ℃冰箱中。采用紫外分光光度計測定樣本RNA的濃度及RNA量，在1.5 mL tube中用EASY Dilution稀釋cDNA標準品，按照組份配制反應液，37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃ 5 sec滅活反轉(zhuǎn)錄酶。將SYBR Premix EX TaqTM 12.5 μL、上下游引物10 μmol/L各0.5 μL、無菌水9.5 μL、cDNA 1 μL混合均勻，配置成Real-time PCR反應試劑。按照反應條件進行Real-Time PCR反轉(zhuǎn)錄反應。引物序列如下：GAPDH：F：5-CAGGAAATGATGACCTCCTGAAC-3、R：5-TGTTTTTGTAAGTATCTTGGTGCC-3;CTGF：F：TAGCTGCCTACCGACTGGAA、R：CTTAGAACAGGCGCTCCACT。

1.2.3.4 肺組織病理形態(tài)觀察 實驗大鼠斷頭處死后，結(jié)扎并分離右肺中葉，一部分肺組織置于4%多聚甲醛固定，乙醇逐級脫水，浸臘包埋，制備臘塊，切片機切片，進行Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學改變。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS for Windows 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清HYP、HA和LN含量比較 與正常組比較，模型組HYP、HA和LN含量明顯升高（P<0.05或P<0.01），與模型組比較，補腎通絡高劑量組、氫化可的松琥鉑酸鈉對照組HYP、HA和LN含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），補腎通絡低劑量組LN含量顯著降（P<0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織CTGF表達比較 與正常組比較，模型組大鼠CTGF表達升高（P<0.01）;與模型組比較，補腎通絡高劑量組、低劑量組和氫化可的松琥鉑酸鈉對照組CTGF表達均降低（P<0.01）。見圖1，表2。

2.3 各組大鼠肺組織CTGFmRNA表達比較 與正常組比較，模型組大鼠CTGFmRNA表達升高（P<0.01）;與模型組比較，補腎通絡高劑量組大鼠CTGFmRNA表達降低（P<0.05），氫化可的松琥鉑酸鈉對照組CTGFmRNA表達降低（P<0.01）。見表3。

2.4 病理組織觀察 肺組織切片經(jīng)Masson染色后，膠原纖維呈現(xiàn)亮綠色，肌肉、胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色，胞核呈現(xiàn)藍黑色。正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，沒有纖維化表現(xiàn)。模型組肺泡肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)有炎性反應細胞的滲出，肺間質(zhì)可見大量的膠原纖維增生、沉積，出現(xiàn)條索狀、片狀、灶狀的纖維化區(qū)域。中藥高、低劑量組肺纖維化程度與模型組比較均明顯減輕，肺間隔略增寬，間質(zhì)內(nèi)可見小灶狀膠原纖維沉積，病變范圍較小。氫化可的松琥鉑酸鈉對照組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，肺泡隔增厚，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見膠原纖維增生及炎性細胞浸潤。見圖2。

3 討論

肺纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學的概念，中醫(yī)學無此名的記載，多數(shù)學者將肺纖維化歸屬于“肺痿”“肺痹”“咳喘”等病證范疇?！端貑枴け哉摗氛J為肺痹乃“皮痹不已，復感于邪，內(nèi)舍于肺”，則為肺痹，“肺痹者，煩滿喘而嘔”。在《素問·痿論》中，指出了肺痿乃“肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著則生痿躄也”。肺纖維化患者多為年老體弱，肺腎氣虛，津液不布，津停為痰，痰瘀阻絡而成本證。腎為氣之根，納攝無力，氣喘難平;痰瘀為病之源，痰瘀阻絡，肺絡不通，纖維化難去。故本證“以本虛標實為主要病機，正虛主要是肺脾腎三臟的虛損，標實主要是痰瘀互結(jié)[3]。故治療應補益肺腎治本，化痰通絡治標，以補腎通絡為大法。在早期的治療中，不少醫(yī)家支持此法，如趙晶晶等認為[4]，肺氣虛弱以及絡氣不足易致痰瘀交互，阻滯肺絡是肺纖維化的基本病機之一。景菲等認為[5]久病肺虛為肺纖維化的主要原因，痰瘀互阻為病機關鍵，本虛標實為主要特點，提出補益氣血，化瘀通絡為本病的主要治法。閆玉琴等[6]認為肺腎兩虛，痰瘀阻絡為其主要病機，虛實夾雜貫穿于疾病的始終。肖娜等[7]認為肺纖維化患者以肺腎氣虛，痰瘀互結(jié)最為常見。樊茂蓉等[8]則認為宗氣虛陷，肺絡痹阻是肺纖維化的發(fā)病的關鍵。楊穎溪等[9]則支持肺腎虧虛，微型癥瘕理論，提出補腎益肺消癥方（補腎益肺消癥方組成：當歸、熟地黃、陳皮、法半夏、浙貝母、水蛭、炙甘草）治療該病的方法。李蓉等[10]認為補腎通絡法（藥物選用南沙參、五味子、蟬蛻、僵蠶、地龍、全蝎等）是治療肺纖維化的有效方法之一。國醫(yī)大師晁恩祥[11]則以養(yǎng)陰益氣，降氣平喘為基本治法，基礎方為：太子參，麥冬，五味子，黃精，山茱萸，蘇子，地龍，白果?？傊姸噌t(yī)家推崇補虛通絡的方法，補虛則以肺、腎為主。筆者通過多年臨床體會，認為肺纖維化補虛應側(cè)重于腎，活血應以通脈絡為主[12]，因此選定了補腎通絡方。該方以西洋參補氣養(yǎng)陰，清熱生津;蛤蚧、蟲草花補益肺腎，納氣平喘;浙貝母、僵蠶清熱化痰散結(jié);三七、桃仁活血化瘀，全蝎、穿山甲、地龍通經(jīng)活絡。全方補肺益腎、化痰通絡并行，使補肺腎而不致燥，化痰瘀而不傷正。本研究顯示，肺纖維化模型大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁破壞，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)有炎性反應細胞滲出，肺泡隔明顯增厚，可見大量膠原纖維增生、沉積，說明肺內(nèi)細胞外基質(zhì)的合成明顯增加，且存在炎性反應。經(jīng)補腎通絡方治療后，大鼠肺部的炎性反應明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較完整，間質(zhì)膠原沉積減少，表明本方能夠改善肺纖維化異常的組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

羥脯氨酸（HYP）是機體膠原纖維所特有的氨基酸，約占正常膠原蛋白的13.4%，通常將HYP含量作為衡量膠原組織代謝的重要指標，由于它在肺組織中的含量與肺間質(zhì)纖維化程度密切相關，故也常將HYP含量作為判斷肺間質(zhì)纖維化程度的重要指標[13]。層粘連蛋白（LN）是一種大分子非膠原糖蛋白，主要存在于基底膜透明層中，能夠誘導細胞黏著、生長與分化等，能吸引、黏附肺上皮細胞、成纖維細胞及炎性細胞，并刺激T淋巴細胞和巨噬細胞分泌淋巴因子而促進成纖維細胞和上皮細胞合成膠原[14]。層粘連蛋白的增加可致炎性細胞積聚于基底部膜，損傷肺組織，直接導致肺纖維化[15]。透明質(zhì)酸（HA）是一種主要的大分子黏生糖胺聚糖.可由Ⅱ型肺上皮細胞、內(nèi)皮細胞及肺成纖維細胞分泌，在致病因子（如氧自由基）的刺激下，成纖維細胞可合成大量HA。HA在肺組織主要分布于毛細血管和細支氣管周圍的間質(zhì)中，可表達于細胞外基質(zhì)，也可表達于細胞表面[15]。在肺纖維化發(fā)展進程中，HA具有較高的敏感度，隨著肺纖維化程度加重，患者血清中HA含量上升，且含量與肺纖維化程度呈正相關[16-17]。研究顯示，HA很可能在肺纖維化早期——肺泡炎階段的肺間質(zhì)水腫中起重要作用[18]。在中醫(yī)藥的實驗研究中顯示，具有補肝腎，活血化瘀的藥物均能降低羥脯胺酸及層粘連蛋白的含量。如宋占帥等[19]使用具有補氣活血作用的補陽還五湯（生黃芪、當歸尾、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍）治療肺纖維化的結(jié)果顯示，可降低透明質(zhì)酸、層粘連蛋白水平，從而抑制膠原纖維的增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積。吳曉東等[20]使用具有抗氧化，保肝腎作用的大黃素和具有擴血管、活血化瘀作用的丹參素聯(lián)合使用試驗，證實該藥具有降低羥脯胺酸、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白含量的作用。本實驗使用具有補腎活血通絡的藥物組方，試驗顯示，比較正常大鼠，模型大鼠血清HYP、LN、HA的含量升高，說明肺纖維化加重，造模成功。經(jīng)補腎通絡方干預之后肺纖維化3項指標的含量下降，說明本方可以抑制炎性反應，減少膠原的沉積，有效改善肺纖維化。

肺纖維化是許多慢性肺疾病的共同病理結(jié)局，主要表現(xiàn)為成纖維細胞的病理性增生和細胞外基質(zhì)病理性聚集。CTGF是一種富含半胱氨酸的多肽，廣泛存在于人類肝臟、腎臟、心臟、肺和結(jié)締組織等多種組織器官中，是許多促纖維化刺激的共同下游因子，參與細胞增生、分化及創(chuàng)傷修復等病理生理活動。在肺組織中，Ⅱ型肺泡上皮細胞和活化的成纖維細胞通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生CTGF，并介導成纖維細胞增殖，促進細胞外基質(zhì)和膠原沉積，加強組織修復和促進肺纖維化[21]。研究表明，慢性阻塞性肺病患者血清CTGF、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原水平均高于健康對照組，且與肺纖維化病程相關，提示CTGF含量與肺組織纖維化關系十分密切[22]。有研究顯示[23]，CTGF在博萊霉素誘導的肺纖維化動物模型中高度表達，肺纖維化前期纖維化的發(fā)生與TGF-β、ICAM-1、CTGF 3種細胞因子均有密切關系，三者可能起協(xié)同作用。

本實驗中，與正常組比較，肺纖維化模型大鼠肺組織CTGF和CTGFmRNA表達顯著升高，同時肺纖維化病理形態(tài)表現(xiàn)加重，說明CTGF表達升高在肺纖維化中發(fā)揮重要作用，補腎通絡方治療后，肺組織CTGF和CTGFmRNA表達均下降，顯示該方藥抑制肺纖維化作用可能與調(diào)節(jié)CTGF表達有關。

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（2018-07-25收稿 責任編輯：王明）