朱崇文 戴林建 等

摘 ?要：為了解高鉀烤煙苗期根系在低鉀脅迫下的差異表達蛋白及其作用機理，本研究分別提取低鉀和正常鉀營養(yǎng)液培育的高鉀烤煙品系HKDN-5的苗期根系蛋白，酶解后采用液相色譜串聯(lián)質譜和label-free蛋白定量技術對差異表達蛋白進行鑒定分析。結果表明，與正常鉀相比，低鉀組共發(fā)現(xiàn)681個差異表達蛋白，其中有359個發(fā)生下調表達，322個上調表達。差異表達蛋白主要參與脂質代謝、次生代謝、碳水化合物代謝和遺傳信息加工等途徑。其中，下調蛋白具有翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋白相關功能的數(shù)量最多，上調蛋白主要為一般功能相關蛋白。差異倍數(shù)較大的蛋白主要與代謝和應激反應過程相關。以上結果表明，低鉀脅迫產(chǎn)生的差異蛋白主要參與物質代謝及應激反應等相關過程。

關鍵詞：高鉀烤煙;苗期根系;低鉀;label-free蛋白定量技術;差異蛋白質

中圖分類號：S572.01 ?????????文章編號：1007-5119（2019）01-0058-09 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.008

Abstract： To understand the differential expression proteins and their functional mechanisms in root system of seeding stage high potassium flue-cured tobacco under low potassium stress， root proteins were extracted from seedling stage high potassium flue-cured tobacco variety HKDN-5 cultivated in low potassium and normal potassium nutrient solutions. After enzymolysis LC-MS and label-free protein quantification technique were used to identify and analyze the differential expression of proteins. The results showed that there were 681 differentially expressed proteins in the low potassium group compared with the normal potassium group， 359 proteins were down regulated and 322 proteins were up regulated. Differential expression proteins were mainly involved in lipid metabolism， secondary metabolites biosynthesis， carbohydrate metabolism and genetic information processing. The highest number of down regulated proteins was identified with the function of post translational modification， protein transformation， and chaperone related functions， the up regulated proteins were mainly the general functional related proteins. The proteins with large change folds were mainly related to metabolic and stress response processes. The above results indicated that the differential proteins produced by low potassium stress may participate in related processes such as substance metabolism and stress responses.

Keywords： high potassium flue-cured tobacco; root system of seedling stage; low potassium; label-free protein quantitative technique; differential protein

鉀是烤煙重要的品質元素，能顯著改善煙葉的燃燒性和煙葉品質，降低煙葉焦油產(chǎn)生量，對提高煙葉可用性、煙草生長發(fā)育起重要作用[1]。根系是煙草吸收土壤中水分和養(yǎng)分以及合成激素、生物堿的重要器官，煙草根系發(fā)育的好壞，直接影響煙株的長相、長勢，進而影響煙草的產(chǎn)量、質量及內(nèi)在品質[2]。高鉀烤煙品系是戴林建等[3]利用花粉管通道法將空心蓮子草等高鉀作物的DNA導入煙草品種K326，經(jīng)過單株選擇法和數(shù)年的比較鑒定而獲得。該品系主要表現(xiàn)為農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，株高、節(jié)距、莖圍等農(nóng)藝性狀和葉片中總氮、蛋白質、煙堿、鉀含量等化學成分較普通烤煙優(yōu)勢明顯[4]，鉀含量也高于普通烤煙品種，缺點是抗病性較差[5]。

蛋白質組一詞最早是由澳大利亞科學家WILKINS和WILLIAMS于1994年提出[6]。蛋白質為基因功能的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，探討蛋白質的表達模式和功能模式，才能更好地認識生命活動的現(xiàn)象和本質[7]。JIN等[8]采用2-DE和毛細管液相色譜串聯(lián)質譜的方法研究了煙草幼苗受到4 ℃低溫傷害4 h以后葉片的蛋白質表達情況，處理葉片中下調表達的蛋白點有21個，上調表達的蛋白點8個。這些差異表達蛋白質主要與信號轉導、蛋白質加工、光合作用、光呼吸、碳氮代謝和能量代謝相關。label-free是一種無標記定量蛋白質組學技術，一般分成兩種方法：其一是基于譜圖峰高、譜圖峰面積和譜圖峰容量等，為信號強度法;其二是基于肽段匹配的二級譜圖數(shù)目，為譜圖計數(shù)法[9]。理論上，label-free可應用于任何樣本的蛋白質定量分析，可對不同來源的同一樣本的定量數(shù)據(jù)進行互相比較，且數(shù)據(jù)移植性高[10]，適應范圍廣。弓青霞等[11]應用label-free蛋白定量技術研究牙囊細胞（hDFCs）和牙周膜成纖維細胞（hPDLFs）差異表達蛋白質，發(fā)現(xiàn)當hDFCs分化成hPDLFs后，有22個差異表達蛋白，其中下調15個，上調7個，這些差異蛋白為研究hDFCs向hPDLFs的轉化機制提供方向。

本研究以自主培育的高鉀烤煙品系苗期根系為材料，采用label-free蛋白質組學技術結合液質聯(lián)用技術，對低鉀營養(yǎng)液和正常鉀營養(yǎng)液分別培育的煙苗根系的蛋白表達進行比較研究，分析低鉀脅迫下煙苗根系蛋白的差異表達，并初步探討差異表達蛋白的作用機制，為煙草品種選育與栽培調控提供基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?供試材料

高鉀烤煙品系HKDN-5種子由湖南農(nóng)業(yè)大學提供。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?材料種植 ?取試驗煙草材料，播種于育苗盤中進行水培培養(yǎng)。試驗材料分為兩組，一組加低鉀營養(yǎng)液實行低鉀處理（K+濃度為0 mg/L），即把Hoagland's營養(yǎng)液中的硝酸鉀和磷酸二氫鉀用等量的硝酸鈉和磷酸二氫鈉代替;另一組加正常Hoagland's營養(yǎng)液作為對照處理（K+濃度為240 mg/L）。均在溫度為25～30 ℃、光照充足等適宜條件下培養(yǎng)。

1.2.2 ?樣品采集和蛋白質制備及濃度測定 ?待試驗煙苗生長到5～6片真葉時，每組選取長勢均勻的4～5株煙苗，取其根系制成混合樣，每組設3個重復，迅速投入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

每組取適量根系樣品在液氮中研磨至粉末。加入2 mL細胞裂解液[30% sucrose，0.5 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，20 mmol/L DTT，0.1 mol/L KCl，2% SDS，1% Protease Inhibitor Cocktail（100×）]，于冰上超聲裂解1 h，低溫離心（4000×g，4 ℃，30 min）。后加入等體積的Tris-HCl苯酚飽和溶液，4 ℃下震蕩30 min使其混勻?；旌弦旱蜏仉x心（4000×g，4 ℃，15 min），取其上層酚相。重復萃取1次，加入5倍體積的丙酮溶液混勻，于?20 ℃沉淀過夜。高速離心（16 000×g，4 ℃，15 min）沉淀蛋白質，棄上清，沉淀用丙酮溶液漂洗2次，每次漂洗后均要離心。真空干燥沉淀，保存于?20 ℃中待用。蛋白濃度的測定采用Bradford[12]法進行測試。

1.2.3 ?蛋白酶解 ?精準取出100 μg凍干樣品轉移至新試管中，用8 mol/L尿素調至100 μL定容。加入11 μL 1 mol/L DTT，在37 ℃下孵育1 h后，將樣品加到10 kDa超濾管（Millipore，Billerica）中，14 000×g離心10 min，之后加入120 μL 55 mmol/L碘乙酰胺，室溫下避光溫育20 min。在超濾管中用100 mmol/L TEAB連續(xù)離心3次置換尿素體系后，加入Trypsin（Promega），蛋白∶酶=50∶1，酶解過夜，凍干。

1.2.4 ?nano-HPLC-MS/MS分析 ?將凍干后的肽段重溶于30 μL 0.1%甲酸水溶液中，后用nano-LC分離，經(jīng)在線電噴霧串聯(lián)質譜分析。實驗在Nano ACQUITY UPLC系統(tǒng)（Waters Corporation， Milford， MA）上進行，系統(tǒng)連接裝有在線nano電噴霧離子源的Q-Exactive質譜儀（Thermo Fisher Scientific， MA， USA）。Q-Exactive質譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運行，自動在MS和MS/MS采集間切換。在70 kDa質量分辨率下獲得全掃描譜圖（m/z 300～1800），隨后在17.5 kDa分辨率下進行后續(xù)HCD MS/MS掃描，動態(tài)排除時間20 s。10 μL肽段樣品以10 μL/min流量上樣到捕集柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18， 100 μm×2 cm），隨后在分析柱（Acclaim PepMap C18， 75 μm×15 cm）中以線性梯度分離：120 min內(nèi)3% A至32% A（A： 0.1% 甲酸ACN溶液）。柱子在初始條件下平衡10 min，柱流量控制在300 nL/min，電噴霧電壓2 kV。

1.2.5 ?數(shù)據(jù)分析 ?串聯(lián)質譜圖經(jīng)過PEAKS Studio version 8.5（Bioinformatics Solutions Inc.， Waterloo， Canada） 分析。PEAKS DB對UniProt-Nicotiana數(shù)據(jù)庫（ver.201711， 73606 entries）搜庫，設置trypsin酶解。搜庫參數(shù)碎片離子質量容許誤差：0.05 Da;母離子質量容許誤差：0.001‰;最大漏切數(shù)：2;固定修飾：Carbamidomethylation 57.02;可變修飾：Oxidation （M） 15.99;Deamidation（NQ）0.98;Acetylation （Protein N-term） 42.01。肽段經(jīng)過1% FDR和1 unique peptide質控過濾。篩選差異倍數(shù)1.5倍以上，含有至少2條unique肽段，根據(jù)ANOVA算法取significance大于13（即p<0.05）的蛋白作為差異表達蛋白。并對蛋白進行GO（Gene Ontology）注釋分析蛋白的分子功能、細胞中所處的位置以及參與的生物過程，COG&KOG注釋分析進行蛋白功能預測、分類，取富集到該通路的p<0.05的Pathway代謝通路分析蛋白參與的生物過程。

2 ?結 ?果

2.1 ?不同鉀濃度下煙草根系表型情況

由圖1和表1可知，正常鉀組雖然根系長度低

于低鉀組，但是其須根數(shù)和主根直徑皆多于或大于低鉀組，且根鮮質量和干質量也大于低鉀組，而低鉀組的干鮮比高于正常鉀組。說明正常鉀濃度組的植株根系較低鉀組發(fā)達，物質積累多，為煙株的生長發(fā)育提供基礎;低鉀組根系含水量太高，而干物質積累不足。

2.2 ?差異蛋白統(tǒng)計

統(tǒng)計低鉀對比正常鉀組差異倍數(shù)為1.5以上，且有顯著性意義（p<0.05）的差異表達蛋白數(shù)量，具體在不同差異倍數(shù)下的差異表達蛋白數(shù)量統(tǒng)計于表2。由表2可知，低鉀組相對于正常鉀組差異表達蛋白總數(shù)為681個，其中下調的蛋白有359個，上調的有322個。上調和下調差異蛋白主要集中在[1.5， 2]差異倍數(shù)區(qū)間，分別占下調差異蛋白和上調差異蛋白總數(shù)的60.4%和43.5%，差異倍數(shù)≥8時，下調和上調蛋白均最少，只占2.2%和5%。1.5≤差異倍數(shù)<2和2≤差異倍數(shù)<4的上調差異蛋白數(shù)目差距不大，而在這兩個區(qū)間下調差異蛋白數(shù)目差距較大。差異蛋白總數(shù)基本上在[1.5， 4]差異倍數(shù)區(qū)間，合計605個，占差異蛋白總數(shù)的88.8%。說明低鉀脅迫主要引起蛋白下調表達，在本試驗的鉀濃度差異下，不會引起蛋白大量發(fā)生差異倍數(shù)較大的表達。

2.3 ?生物信息學分析

2.3.1 ?差異蛋白的GO注釋 ?如表3所示，最多的差異表達蛋白定位在細胞組分、細胞器組分和有膜細胞器中，占差異蛋白總數(shù)的69%;大部分差異表達蛋白參與水解酶活性、離子結合和有機環(huán)與雜環(huán)化合物結合，占差異蛋白總數(shù)的74%;差異表達蛋白參與細胞代謝、有機物代謝、基本代謝、單體代謝、單體細胞過程和氮組分代謝過程的數(shù)量最多，占比為68%。說明低鉀脅迫下的差異蛋白更多定位在細胞組分和有膜細胞器中，具有離子結合、有機環(huán)和雜環(huán)化合物結合等分子功能，參與細胞、有機物和基本代謝等生物過程。

2.3.2 ?差異蛋白的KOG注釋 ?如圖2所示，該圖表示低鉀組對比正常鉀組具有不同功能的差異表達蛋白數(shù)量統(tǒng)計，功能蛋白可分為20類：A，RNA加工及修飾;B，染色體結構與動力學;C，能量產(chǎn)生和轉換;E，氨基酸運輸和代謝;F，核苷酸運輸和代謝;G，碳水化合物運輸和代謝;H，輔酶運輸和代謝;I，脂質運輸和代謝;J，翻譯、核糖體結構和生物起源;K，轉錄過程;L，復制、重組和修復;M，細胞壁、細胞膜和包膜的生物起源;O，翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋白;P，無機離子運輸和代謝;Q，次生代謝產(chǎn)物生物合成運輸和分解代謝;R，一般功能;S，未知功能;T，信號傳導機制，U，胞內(nèi)運輸、分泌和膜泡運輸;Z，細胞骨架等相關蛋白。差異表達蛋白中數(shù)量最多的為O類相關蛋白，數(shù)量最少的為B類蛋白和Z類蛋白。681個差異蛋白中，有532個具有KOG號，對這些具有不同功能的差異表達蛋白數(shù)量進行統(tǒng)計（表4），可知上調蛋白數(shù)量最多的為R類蛋白，數(shù)量最少的為B類蛋白和L類蛋白，下調蛋白數(shù)量最多的為O類蛋白，數(shù)量最少的為Z類蛋白。

2.3.3 ?差異蛋白的KEGG pathway分析 ?KEGG數(shù)據(jù)庫可以確定蛋白質參與的最主要的信號轉導通路和生化代謝通路，有助于了解基因或蛋白的生物

學功能。根據(jù)低鉀對比正常鉀組差異表達蛋白的KEGG pathway分析可知，這些蛋白共參與99條通路途徑。包括40條代謝通路，24條合成途徑通路等。差異蛋白質參與具有顯著性差異（p<0.05）的通路途徑有：果糖和甘露糖代謝、苯丙素生物合成、蛋白酶體和核苷酸切除修復等與物質代謝和遺傳信息處理相關途徑，說明低鉀脅迫下的苗期根系蛋白主要參與物質代謝和遺傳信息處理相關過程。

3 ?討 ?論

鉀離子是一種礦質離子，它的缺失必然打破離子平衡，影響胞內(nèi)物質的運輸。低鉀脅迫能夠影響金屬礦質離子的運輸、水通道蛋白的活性、ATP的跨膜運輸、氨基酸蛋白質的運輸、硝酸鹽的運輸?shù)萚13]。在本試驗中，由于鉀離子的缺失，造成了諸多與代謝相關轉運蛋白的上調表達，其中包括3個質膜上H+轉運ATP酶、1個Ca2+轉運ATP酶、2個磷酸鹽運輸相關蛋白、1個氯離子通道相關蛋白等。此外，有1個K+轉運蛋白上調也較為明顯。離子ATP酶可利用水解ATP所釋放的能量逆化學和電梯度驅動離子跨質膜運輸，通道蛋白可促進水分和離子順能量梯度擴散[14]。低鉀脅迫中，逆境信號的傳導是通過信號系統(tǒng)完成的，活躍的信號傳導系統(tǒng)通常表現(xiàn)為鈣離子運輸活性增加，調整信號通路過程。然后經(jīng)下游功能基因表達在促進和調控煙草新陳代謝過程中行使功能，以便對煙草自身進行調整來應對低鉀逆境[13]。這便解釋了試驗結果中差異倍數(shù)較大的差異蛋白以參與無機離子運輸和代謝相關過程為主，且全為上調表達的原因。

研究表明，煙草幼苗在缺鉀處理后，產(chǎn)生的差異蛋白主要具有新陳代謝、細胞過程和應激反應相關功能[15]。苧麻在經(jīng)過短時間低鉀處理后，差異蛋白更多具有能量代謝和光合作用等相關功能[16]。棉花幼苗應答低鉀脅迫的蛋白質同樣主要具有能量代謝和脅迫防御相關功能，主要參與植物代謝、脅迫應答及氧化脅迫等生物學過程[17]。植物在缺鉀條件下產(chǎn)生的差異蛋白點不僅與鉀運輸體有關，而且與代謝密切相關，低鉀條件下誘導表達的蛋白，很多屬于物質和能量代謝蛋白[18]。

本文研究結果中，低鉀脅迫下產(chǎn)生的差異蛋白主要參與細胞、有機物等相關代謝過程，具有代謝、細胞過程和環(huán)境信息處理等應激反應相關功能。這與前人研究結果大部分相同，表示與物質代謝和應激反應相關的蛋白能在大部分植物的低鉀脅迫中發(fā)生作用，對植物體正常生長發(fā)育提供保障。

有研究證明煙草[15]、苧麻[16]和棉花[17]等在低鉀脅迫下產(chǎn)生的差異蛋白中與代謝過程相關的主要包括氨基酸氨基轉移酶、ATP合成酶、已糖激酶、磷酸酶類等。而在本試驗鑒定的與代謝相關且差異明顯的蛋白中，除了有ATP酶和磷酸酶類外，還主要包括絲氨酸羧肽酶、δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶、UDP-糖基轉移酶、液泡轉化酶等，其中只有液泡轉化酶發(fā)生下調表達。產(chǎn)生差異的原因可能與低鉀處理時間、植物組織差異或烤煙高鉀品系的特殊性相關。

絲氨酸羧肽酶是一類α/β水解酶家族的蛋白酶，在植物許多生化途徑、生長發(fā)育及抵抗逆境方面發(fā)揮重要作用[19]。δ-1-吡咯啉-5-羧酸合酶可以提高植株脯氨酸的含量，起到抗旱、耐鹽的作用，是植物通過谷氨酸途徑合成脯氨酸的關鍵酶[20]。UDP-糖基轉移酶的上調表達催化了糖基轉移反應，將糖基從活化的供體分子轉移到受體分子上，從而調節(jié)受體分子在細胞和機體內(nèi)的活性，在調節(jié)植物體內(nèi)激素平衡、解除外源毒素毒性以及次生代謝產(chǎn)物的合成、貯存等方面發(fā)揮重要功能[21]。液泡轉化酶通過平衡蔗糖濃度調節(jié)細胞的滲透勢和糖信號，與庫結構的膨大生長密切相關[22]，抑制還原糖的產(chǎn)生，為植物代謝途徑提供能量。故此，該酶發(fā)生下調表達，這與煙草液泡轉化酶抑制子的作用相符[23]。這些酶在高鉀烤煙根系物質代謝相關過程發(fā)揮重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)煙草[15]、苧麻[16]和棉花[17]等植物在低鉀脅迫下的差異蛋白中與應激反應相關的主要包括超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、轉錄因子等。而在本研究鑒定中，主要為磷脂酰肌醇磷脂酶、尿苷激酶等酶發(fā)生上調表達、木質部半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶等發(fā)生下調表達。鑒定的差異蛋白存在不同，可能與鉀處理的時間不同或烤煙高鉀根系的特殊性相關，能為烤煙高鉀品系的差異蛋白質組學提供研究基礎。

磷脂酰肌醇磷脂酶在植物中信號傳導途徑有著很大作用，能夠參與調控防御反應和滲透調節(jié)等方面[24]。尿苷激酶能夠催化尿苷磷酸化，是嘧啶核苷酸補救合成途徑中的關鍵酶[25]，在植物體核苷酸代謝發(fā)揮作用。木質部半胱氨酸蛋白酶是植物管狀細胞凋亡過程中的自溶酶，參與植物與多種病原物互作[26]。同時，半胱氨酸蛋白酶也參與種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、組織分化、衰老、細胞程序性死亡和各種脅迫應答等生物學過程[27]，該酶與天冬氨酰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶都參與蛋白水解機制[28]。在逆境環(huán)境下，不利于蛋白合成和生長發(fā)育的蛋白下調表達，符合維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的要求。

試驗鑒定結果中還發(fā)現(xiàn)幾丁質酶、咖啡酸-O-甲基轉移酶和2-烯醛還原酶等酶發(fā)生上調表達，其在煙草根系生長發(fā)育過程的作用也不容忽視。

幾丁質酶是植物重要的防衛(wèi)因子，在植物生長發(fā)育、抗逆和防御反應中發(fā)揮重要作用[29]。苯丙素生物合成途徑是植物生長發(fā)育過程中重要的途徑之一，該途徑會產(chǎn)生重要的生理代謝產(chǎn)物，在植物發(fā)育、機械支持和抗病等方面發(fā)揮著重要作用[30]，咖啡酸-O-甲基轉移酶作為該途徑的關鍵酶，在植物抗逆過程中發(fā)揮重要的作用[31]。研究證明，醛能夠參與植物逆境下的毒害作用以限制植物生長，而2-烯醛還原酶能夠有效的清除醛[32]，有助于植物生長發(fā)育。

此外，還有抗病相關蛋白、囊泡復合物亞基、轉運相關蛋白都發(fā)生上調表達，無疑在機體抗病方面、物質運輸和轉運等方面發(fā)揮重要作用，保證植物體正常生長發(fā)育。

4 ?結 ?論

本研究通過label-free定量蛋白質組學技術對低鉀脅迫下高鉀烤煙品系HKDN-5苗期根系差異表達蛋白進行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)大部分差異表達蛋白定位在細胞組分、細胞器組分和有膜細胞器中，具有水解酶活性、離子結合、有機環(huán)與雜環(huán)化合物結合等分子功能，參與細胞、有機物、單體和氮組分等相關代謝過程。差異表達蛋白在低鉀脅迫中具有翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋白相關功能的數(shù)目最多，且主要參與物質和能量代謝以及遺傳信息加工和生物合成等通路途徑，在煙草根系代謝和逆境應激反應過程發(fā)揮關鍵性作用。本文初步探討了低鉀脅迫下煙草根系的應答機理，但未對所得到的差異蛋白在應答機制中的具體作用進行詳細闡述，差異蛋白在煙草鉀積累、根系生長發(fā)育中的相關作用尚需深入探究。

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