張?jiān)?孫澤坤 駱衡 戴仁懷

摘 要：為了探究中華真地鱉血淋巴對(duì)癌細(xì)胞（PC3、HEL、WM9、MDA-MB-231）體外生長(zhǎng)的影響。采用穿刺法收集地鱉蟲(chóng)血淋巴及MTT法研究中華真地鱉血淋巴的抗癌活性，同時(shí)用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Hoechst 33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步確定中華真地鱉血淋巴對(duì)HEL紅白血病細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，中華真地鱉血淋巴對(duì)四種癌細(xì)胞均有體外抑制作用，且對(duì)HEL細(xì)胞具有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：中華真地鱉;血淋巴;抗癌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：R73-74

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）01-0048-03 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.009

中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker）屬蜚蠊目，鱉蠊科，是一種重要的藥用昆蟲(chóng)[1]。其干燥體是中藥中一種常用的保健品[2]，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)豐富的成分[3]。雌蟲(chóng)可以入藥，具有消腫散結(jié)，下乳通經(jīng)等功效[4]。此外，多項(xiàng)研究表明地鱉蟲(chóng)提取物具有抗血栓[5-7]、抗腫瘤[8-9]和抗氧化活性[10]等作用。

昆蟲(chóng)血淋巴是淋巴液和血液的混合物，在昆蟲(chóng)的防御、免疫應(yīng)答等方面起著重要作用，近年來(lái)已成為昆蟲(chóng)研究中最常用的研究材料之一[11]。楊佳琪等[12-13]發(fā)現(xiàn)九香蟲(chóng)（Aspongopus chinensis Dallas）血淋巴能顯著抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，且能通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡。研究人員也發(fā)現(xiàn)經(jīng)誘導(dǎo)的中華真地鱉血淋巴具有明顯的抑菌效果[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)中華真地鱉血淋巴分別對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞、人紅白血病HEL細(xì)胞、人黑色素瘤WM9細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用，用Hoechst 33258染色法檢測(cè)血淋巴刺激后的細(xì)胞凋亡情況，旨在為進(jìn)一步研究地鱉蟲(chóng)抗癌活性提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

胎牛血清（FBS）購(gòu)于四季青公司（中國(guó)，杭州），RPIM-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone公司（美國(guó)），青鏈霉素、MTT和DMSO試劑試劑購(gòu)自索萊寶公司（中國(guó)，北京），細(xì)胞Hoechst 33258凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所（中國(guó)，上海）。

1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀SYNERGY-H4（美國(guó)，Biotek）;尼康倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（日本，Nikon）;細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱FormaTMⅡ3110系列水套CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo scientific）;Allegra X-15R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)，BECAKMAN）。

1.3 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞PC3、人紅白血病細(xì)胞HEL、人黑色素瘤細(xì)胞WM9、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231是從貴州省中科院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴州，貴陽(yáng)）獲得，用含10%牛胚胎血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 地鱉蟲(chóng)血淋巴提取

中華真地鱉成蟲(chóng)購(gòu)于山東濟(jì)寧，用滅菌水擦拭其身體后，通過(guò)穿刺法收集中華真地鱉的血淋巴粗提物，通過(guò)高速冷凍離心（12000 rpm，4℃，30 min），用0.22 μm濾膜過(guò)濾之后獲得較為純凈的血淋巴用于活性檢測(cè)。

1.5 MTT分析

MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：以每孔5103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞過(guò)夜生長(zhǎng)后分別加入不同濃度的血淋巴，設(shè)置復(fù)孔5個(gè)。在37℃、5%CO2濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結(jié)束后，加入MTT溶液20 μL，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，高速離心后倒掉孔內(nèi)的上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)測(cè)定光吸收值（OD值）。設(shè)加緩沖液為對(duì)照。據(jù)公式計(jì)算（細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%）計(jì)算癌細(xì)胞的存活率。

1.6 Hoechst 33258染色

以每孔5105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板上，加入不同濃度的血淋巴，處理24 h。隨后將細(xì)胞收集進(jìn)EP管中，用PBS洗兩次，按照Hoechst 33258 試劑盒指示檢測(cè)血淋巴處理后細(xì)胞核固縮情況。染色細(xì)胞核立即在熒光顯微鏡（日本，尼康公司）下拍攝。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 21 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析（One way ANOVA），以P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著差異。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（mean SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 地鱉蟲(chóng)血淋巴對(duì)4種癌細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示，不同濃度的地鱉蟲(chóng)血淋巴作用于PC3、HEL、WM9、MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，細(xì)胞活力隨著血淋巴濃度增加而減少。在血淋巴濃度為100 μL/mL時(shí)，對(duì)各細(xì)胞抑制最顯著，各處理組相對(duì)于對(duì)照組的細(xì)胞活力分別為（26.40±0.72）%、（60.56±1.82）%、（49.72±4.59）%、（54.17±2.30）%，呈現(xiàn)出較好的抑制效果。其中地鱉蟲(chóng)血淋巴對(duì)HEL細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制最顯著，隨著血淋巴濃度增加，細(xì)胞活力較其他三種細(xì)胞下降更為迅速，表現(xiàn)出對(duì)HEL細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制作用。

2.2 地鱉蟲(chóng)血淋巴對(duì)紅白血病HEL細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258為非嵌入性熒光染料，能使活細(xì)胞或固定細(xì)胞細(xì)胞核著色。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)不同濃度的中華真地鱉血淋巴刺激48 h后的紅白血病HEL細(xì)胞株，隨著作用濃度升高，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體積變小，高濃度下出現(xiàn)致密濃染。

3 結(jié)論與討論

癌癥是全球第二大導(dǎo)致人類(lèi)死亡的原因，2018年美國(guó)新增有174萬(wàn)癌癥病例，61萬(wàn)人死于癌，癌癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康[15]。目前化療藥物的療效較低，副作用仍然居高不下[16-17]。因此，開(kāi)發(fā)新的、毒性更小的抗癌藥物仍然是世界范圍內(nèi)藥物化學(xué)家的一個(gè)重要和具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)[18-19]。昆蟲(chóng)占總生物多樣性的一半以上，在所有的氣候條件的各種極端環(huán)境都有它們的身影，促使研究人員在這類(lèi)節(jié)肢動(dòng)物中尋找新的治療藥物[20]。地鱉蟲(chóng)是一種藥用昆蟲(chóng)，已被記載在《中華人民共和國(guó)藥典》中[21]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)地鱉蟲(chóng)具有抗氧化性，抗癌等藥效[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中華真地鱉血淋巴能抑制4種供試細(xì)胞（人前列腺癌細(xì)胞PC3、人紅白血病細(xì)胞HEL、人黑色素瘤細(xì)胞WM9、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231）的增殖，且呈濃度依賴(lài)性，其中地鱉蟲(chóng)血淋巴對(duì)HEL細(xì)胞的增殖抑制最顯著。Hoechst 33258 染色結(jié)果顯示中華真地鱉血淋巴能誘導(dǎo)紅白血病HEL細(xì)胞凋亡，隨著作用濃度升高，凋亡越明顯。

參 考 文 獻(xiàn)：

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