王青 王曉東 程安瑋 徐同成 王新坤 孫金月

摘?要：為提高水酶法提取牡丹籽油的出油率，研究了果膠酶和纖維素酶復(fù)合酶預(yù)處理對(duì)提油量的影響，結(jié)果表明：果膠酶與纖維素酶比例為2∶1時(shí)，提油量最高;通過(guò)單因素及響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到復(fù)合酶酶解預(yù)處理牡丹籽提油的最佳工藝條件為：pH 4.3、復(fù)合酶添加量2.5%、酶解溫度47℃、酶解時(shí)間2.3h。該工藝參數(shù)下進(jìn)行前處理，再用堿性蛋白酶酶解，每10g牡丹籽的提油量為1.345 8g，換算成提油率約為85%。

關(guān)鍵詞：牡丹籽油;水酶法;復(fù)合酶;提油率

牡丹原產(chǎn)我國(guó)，集中分布在河南洛陽(yáng)、山東菏澤等地區(qū)[1-3]。牡丹不僅觀賞價(jià)值高，也是我國(guó)傳統(tǒng)中藥之一。研究表明，牡丹具有降血糖、抗菌消炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用，牡丹籽目前主要用于提取牡丹籽油。牡丹籽油不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且藥用價(jià)值高、具有多種功效，具有其他多種食用植物油不可比擬的優(yōu)勢(shì)[4-7]。目前對(duì)水酶法提取牡丹籽油的研究較多[8-11]，酶解法提取牡丹籽油也已見(jiàn)諸多報(bào)道[12-14]，但對(duì)于纖維素酶與果膠酶同時(shí)酶解預(yù)處理牡丹籽，再用堿性蛋白酶酶解提取牡丹籽油的相關(guān)文獻(xiàn)較少。本研究用纖維素酶和果膠酶復(fù)合酶解預(yù)處理牡丹籽后，再用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，離心提取油脂后的樣液還可用于牡丹籽活性多肽的制備[15]，使牡丹籽得到充分利用，提高其副產(chǎn)物利用率及附加值。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?材料?油用牡丹籽，購(gòu)于安徽亳州。

1.1.2?試劑?果膠酶、纖維素酶、木瓜復(fù)合酶和堿性復(fù)合酶，上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉和鹽酸，國(guó)藥集團(tuán);食用級(jí)磷酸，上海冠戈實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.3?試驗(yàn)儀器?6202小型高速粉碎機(jī)，臺(tái)灣興實(shí)利和公司;FA1204B精密天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;SK超聲波振蕩，上海昨非實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FE20K臺(tái)式酸度計(jì)，梅特勒-托利多;HH-S電熱恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;WZ01B恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司;101-3AB電熱恒溫干燥箱，上海圣科儀器設(shè)備有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī)，上海飛鴿;海爾冷藏柜，青島海爾有限公司。

1.2?工藝流程

酶解法提取牡丹籽油工藝流程：牡丹籽→粉碎（80目以上）→與水混合并均質(zhì)→復(fù)合酶預(yù)處理→滅酶→堿性復(fù)合酶酶解→滅酶→離心→取上層清油→成品。

1.2.1?酶的篩選?稱取粉碎后樣品10g（以后樣品的取樣量均為10g，后文不在贅述），選擇復(fù)合酶、纖維素酶、果膠酶等進(jìn)行篩選試驗(yàn)。按照纖維素酶pH 4.5、果膠酶pH 4.5、酸性復(fù)合酶pH 4.5、中性復(fù)合酶pH 7.0、堿性復(fù)合酶pH 8.5、復(fù)合復(fù)合酶pH 8.5，酶解溫度45℃、酶解時(shí)間2 h進(jìn)行處理，選出油脂提取最佳的酶。

1.2.2?復(fù)合酶前處理?xiàng)l件的選擇?采用纖維素酶與果膠酶的復(fù)合酶進(jìn)行前處理。按照纖維素酶與果膠酶混合比例為不添加、添加纖維素酶、纖維素酶∶果膠酶為5∶1、纖維素酶∶果膠酶為2∶1、纖維素酶∶果膠酶為1∶1、纖維素酶∶果膠酶為1∶2、纖維素酶∶果膠酶為1∶5、添加果膠酶，篩選出復(fù)合酶的最佳比例。采用復(fù)合酶添加量3%、酶解pH 4.5、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間2 h的條件進(jìn)行試驗(yàn)，以期能提高復(fù)合酶的酶解效率。

1.3?單因素試驗(yàn)

以酶解pH、復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間等提取條件對(duì)牡丹籽油提取率的影響分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。pH選擇3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5進(jìn)行單因素試驗(yàn)驗(yàn)證，復(fù)合酶添加量選擇0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%進(jìn)行單因素試驗(yàn)驗(yàn)證，酶解溫度選擇35、40、45、50、55、60℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)驗(yàn)證，酶解時(shí)間選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.4?提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇與提油作用關(guān)系密切的4個(gè)因素即pH、復(fù)合酶添加量、提油溫度和提油時(shí)間作為自變量，進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-expert軟件對(duì)通過(guò)多組試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，最終得到優(yōu)化的試驗(yàn)工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同酶處理對(duì)牡丹籽提油率的影響

不同的酶處理牡丹籽，對(duì)其提油率的影響差別較大。圖1表明，纖維素酶、木瓜復(fù)合酶、果膠酶與酸性復(fù)合酶酶解處理時(shí)提油率較低;中性復(fù)合酶、堿性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶酶解時(shí)提油量相對(duì)較高，其中，堿性蛋白酶酶解時(shí)牡丹籽的提油率最高。因此，該選擇堿性蛋白酶為主要水解酶。

2.2?復(fù)合酶前處理對(duì)提油率的影響

單一的堿性復(fù)合酶水解牡丹籽提油時(shí)，提油率并不高。采用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行前處理，再用堿性復(fù)合酶進(jìn)行酶解，牡丹籽的提油率有顯著的提高。圖2表明，添加纖維素酶或果膠酶進(jìn)行酶解前處理能有效提高牡丹籽蛋白的提油率，將纖維素酶和果膠酶混合酶解比例為2∶1時(shí)，提油的效果最好。

2.3?單因素試驗(yàn)

不同的單因素條件下，復(fù)合酶前處理的提油效果不同。圖3表明，隨著pH的提高，提油率逐漸升高;當(dāng)pH為4.0時(shí)，提油量最高，而后隨著pH增加，提油率逐漸降低。原因可能是試驗(yàn)用復(fù)合酶的最適pH接近4.0，pH在4.0附近時(shí)，酶活性最高，酶對(duì)底物作用的效果明顯，提油率高。在一定范圍內(nèi)，隨著酶量的增加，提油率提高，當(dāng)酶量達(dá)2%時(shí)，提油率接近最大值，但酶量超過(guò)2%時(shí)，提油量趨于穩(wěn)定;當(dāng)提油溫度低于45℃ 時(shí)，提油率隨溫度的升高而提高，當(dāng)溫度高于45℃ 時(shí)，提油率隨溫度的升高而降低，此后超過(guò)酶的最適溫度，酶活性降低，同時(shí)過(guò)高溫度使酶變性失活，提油率下降，因此選取的最適溫度為45℃;當(dāng)時(shí)間小于2h時(shí)，提油率呈上升趨勢(shì)，變化程度較明顯，2h后提油率不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，反而呈下降趨勢(shì)。3529DBB4-0592-409E-B621-2A611E9124B9

2.4?響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.4.1?響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)?在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益及牡丹籽油品質(zhì)，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各酶解參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響，得到酶解的最佳條件（表1～2）。

2.4.2?模型的建立及顯著性檢驗(yàn)?利用Design-expert軟件對(duì)表2.2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型：

R1=1.48+0.25*A+0.21*B+0.14*C+0.065*D+0.060*A*B+0.058*A*C+0.062*A*D+0.12* B*C+0.048*B*D-0.031* C*D-0.29* A?2-0.15*B?2-0.27*C?2-0.22*D?2

表3結(jié)果表明，模型極顯著（P<0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R?2=0.909 3），模型調(diào)整確定系數(shù)RAdj?2=0.818 6，說(shuō)明該模型能解釋響應(yīng)值的變化，擬合程度較好，失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說(shuō)明本試驗(yàn)所得二次回歸方程高度顯著，能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)A、B、C及二次項(xiàng)A?2、C?2、D?2表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明它們對(duì)響應(yīng)值影響極大。根據(jù)F值的大小順序可以推斷，對(duì)響應(yīng)值的影響程度順序依次為：pH>蛋白酶添加量>酶解溫度>酶解時(shí)間。由響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最優(yōu)值為pH 4.31、復(fù)合酶添加量2.5%、酶解溫度47.67℃、酶解溫時(shí)間2.31h，在此工藝參數(shù)下進(jìn)行前處理，再用堿性蛋白酶酶解，牡丹籽提油量為1.720g。為驗(yàn)證該結(jié)果，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取參數(shù)修正為pH 4.3、復(fù)合酶添加量2.5%、酶解溫度47℃、酶解時(shí)間2.3 h，該工藝參數(shù)下進(jìn)行前處理，再用堿性蛋白酶酶解，牡丹籽提油量為1.720g，提油率約為85%，與理論值接近。因此，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3?結(jié)論

本試驗(yàn)表明，果膠酶∶纖維素酶的比例為2∶1時(shí)提油效果最好;復(fù)合酶酶解預(yù)處理牡丹籽提油的最佳工藝條件為pH 4.3、復(fù)合酶添加量2.5%、酶解溫度47℃、酶解時(shí)間2.3h，該工藝參數(shù)下進(jìn)行前處理，再用堿性蛋白酶酶解，牡丹籽提油量為1.720g，提油率約為85%。

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Effect of Enzymolysis Pretreatment on Peony Seeds Oil Extraction Rate by Aqueous Enzymatic Method

WANG Qing，WANG Xiao-dong，CHENG An-wei，XU Tong-cheng，WANG Xin-kun，SUN Jin-yue

（Key Laboratory of Novel Food Resources Processing，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Agro-products Processing Technology of Shandong Province/Institute of Agro-food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，China）

Abstract：The effect of pretreatment with complex enzymes of pectinase and cellulase on peony seeds oil extraction rate was studied.The results showed that the peony seeds oil extraction rate was the highest when the ratio of the amount of pectinase to cellulase was 2∶1.The optimal conditions for pretreatment of peony seeds for oil extraction by single-factor tests and response surface method were pH 4.3，enzyme dosage 2.5%，enzymolysis temperature 47℃，and enzymolysis time 2.3 h.Under the above pretreatment conditions combined with alkaline protease enzymolysis，the peony seeds oil extraction rate was up to 1.345 8g per 10g，and the oil extraction rate was about 85%.

Keywords：peony seed oil;aqueous enzymatic method;complex enzyme;oil extraction rate

（責(zé)任編輯?唐建敏）3529DBB4-0592-409E-B621-2A611E9124B9