池俊玲 趙一博 郭江波 張龍 劉漢陽 辛翠花

摘要：【目的】篩選出鎘（Cd）脅迫下煙草的最佳內(nèi)參基因，為后續(xù)研究與Cd2+相關(guān)的功能性基因提供理論依據(jù)?！痉椒ā糠謩e以0、250和500 mg/L氯化鎘（CdCl2）溶液對(duì)本生煙草進(jìn)行脅迫處理，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測不同濃度Cd2+脅迫處理下肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、微管蛋白基因（TUB）、蛋白磷酸酶2基因（PP2A）、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）及轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1a）6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)情況，并利用geNorm和NormFinder綜合評(píng)價(jià)Ct各內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】以不同濃度Cd2+脅迫處理的本生煙草cDNA為模板均可PCR擴(kuò)增出ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a等6個(gè)內(nèi)參基因。6個(gè)內(nèi)參基因的qRT-PCR擴(kuò)增曲線走勢正常，平行性好，無引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生，且繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)基本分布在一條直線上，擴(kuò)增效率在要求范圍（90.00%～105.00%）之內(nèi)，符合下一步評(píng)價(jià)要求，且斜率的回歸系數(shù)（R2）>0.9800，說明線性關(guān)系較好。GAPDH和EF1a基因的表達(dá)豐度較高，18S rRNA處于中等水平，ACT、TUB和PP2A基因的表達(dá)豐度較低。geNorm分析結(jié)果顯示，6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1a基因>GAPDH基因>ACT基因>TUB基因>PP2A基因>18S rRNA;NormFinder分析結(jié)果顯示，6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)镋F1a基因>TUB基因>GAPDH基因=PP2A基因>ACT基因>18S rRNA?！窘Y(jié)論】EF1a基因在不同濃度Cd2+脅迫處理下表達(dá)水平較高，穩(wěn)定性最好，可作為Cd脅迫下本生煙草的最佳內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞： 煙草;鎘脅迫;實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）;內(nèi)參基因;篩選

中圖分類號(hào)： S572? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：2095-1191（2019）10-2133-08? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Screening of internal reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR under different concentrations of

Cd2+ stress in tobacco

CHI Jun-ling， ZHAO Yi-bo， GUO Jiang-bo， ZHANG Long，

LIU Han-yang， XIN Cui-hua*

（School of Life Science and Technology， Inner Mongolia University of Science and Technology，

Baotou， Inner Mongolia? 014010， China）

Abstract：【Objective】The optimal reference genes for tobacco under cadmium（Cd） stress were screened，which laid the foundation for the subsequent study of functional genes related to heavy metal Cd2+. 【Method】The tobacco was treated with 0， 250 and 500 mg/L cadmium chloride（CdCl2） solution， and real-time quantitative PCR were used to detect the expression levels of six commonly used internal reference genes， including actin（ACT），tubulin（TUB）， protein phosphatase 2（PP2A），18S rRNA，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH） and elongation factor 1-ɑ（EF1a）， under different concentrations of Cd2+ stress. And the stability of expression of these internal reference genes were evaluated by the geNorm and NormFinder. 【Result】Six internal reference genes of ACT， TUB， 18S rRNA， PP2A， GAPDH and EF1a could be amplified by PCR using the tobacco cDNA treated with different concentrations of Cd2+ stress. The qRT-PCR amplification curves of the six internal reference genes showed normal trend， geed parallelism， no primer dimer and non-specfic bands， and the points on the standard curve were basically distributed on a straight line. The amplification efficiency was within the required range（90.00%-105.00%）， it met the requirements of the next evaluation， and the slope regression coefficient R2>0.9800， indicating a good linear relationship. The expression abundances of GAPDH and EF1a were high and more stable，18S rRNA was in the middle，and the expression? abundances of ACT，TUB and PP2A were low. The expression stability of EF1a was the highest in the geNorm program under different concentrations of Cd2+ stress，followed by GAPDH，TUB，PP2A，ACT and 18SrRNA. The NormFinder analysis showed that the expression stability rank was EF1a>TUB>GAPDH=PP2A>ACT>18S rRNA. 【Conclusion】EF1a has higher expression under diffe-rent concentrations of Cd2+ stress， and is the most stable one. It can be used as the optimal reference gene for tobacco under different concentrations of Cd stress.

Key words： tobacco; cadmium stress; real-time fluorescent quantitation PCR（qRT-PCR）; reference gene; selection

0 引言

【研究意義】鎘（Cd）是生物體非必需且毒性很強(qiáng)的重金屬元素，可導(dǎo)致植物發(fā)生一系列生理生化病變使其新陳代謝紊亂，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)死亡癥狀（Andresen and Kupper，2013;Hui et al.，2015）。煙草（Nicotiana benthamiana）作為一種模式植物，因其生長周期短、個(gè)體小，常被用于研究基因功能。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)，是研究基因功能的有效手段（Maurin，2012），但其檢測結(jié)果的精確性和可靠性常受RNA提取純化質(zhì)量、擴(kuò)增效率及內(nèi)參基因等因素的影響（Li et al.，2015，Ma et al.，2016）。選擇以適宜內(nèi)參基因以控制樣品間的非特異性變異，是有效準(zhǔn)確進(jìn)行基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化處理的前提（Lee et al.，2010）。因此，檢測不同濃度Cd2+脅迫下煙草不同內(nèi)參基因的表達(dá)情況，篩選出煙草在Cd脅迫下的最佳內(nèi)參基因，對(duì)后續(xù)研究Cd2+相關(guān)的功能性基因具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，植物功能性基因研究中常用的內(nèi)參基因包括肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、微管蛋白基因（TUB）、蛋白磷酸酶2基因（PP2A）、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）和轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1a）等（Niu et al.，2015）。Nicot等（2005）對(duì)馬鈴薯在不同生理環(huán)境下內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在生物脅迫下EF1a和18S rRNA序列表達(dá)較穩(wěn)定，鹽脅迫下CYP和EF1a基因表達(dá)較穩(wěn)定，低溫脅迫下EF1a和L2基因表達(dá)較穩(wěn)定。Wang等（2014）篩選非生物脅迫下油菜的最佳內(nèi)參基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽脅迫和干旱脅迫下PP2A基因是最佳內(nèi)參基因，而重金屬Cr6+脅迫下ACT7基因是最佳內(nèi)參基因。崔菲菲等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，大白菜—結(jié)球甘藍(lán)易位體系在不同發(fā)育時(shí)期、組織部位及激素處理下的最適內(nèi)參基因各不相同：UKN1和TUB4基因是營養(yǎng)生長期的最佳內(nèi)參基因;BcT1P41和ACTIN基因是包心期經(jīng)生長素IAA處理下的最佳內(nèi)參基因，但UKN1和BcTIP41基因是生長素抑制劑TIBA處理下的最佳內(nèi)參基因。潘虹等（2019）對(duì)不同光質(zhì)培養(yǎng)的刺葡萄紅色愈傷組織功能性基因的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR檢測時(shí)，分別以a-Tubulin、AP-2、60SRP、EF1a和UBQ基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，利用geNorm、Normfinder和BestKeeper對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析比較，最終確定a-Tubulin和60SRP基因?yàn)樽罴褍?nèi)參基因。張穎等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，ACT和EF1a基因可作為杉木不同組織中功能性基因表達(dá)的qRT-PCR最佳內(nèi)參基因。【本研究切入點(diǎn)】目前，鮮見有關(guān)不同濃度Cd2+脅迫下煙草qRT-PCR內(nèi)參基因篩選的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究不同濃度Cd2+脅迫下本生煙草中ACT、TUB、PP2A、18S rRNA、GAPDH和EF1a等6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)情況，并利用GeNorm和NormFinder對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，最終篩選出最佳內(nèi)參基因，為后續(xù)研究與Cd2+相關(guān)的功能性基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

本生煙草和大腸桿菌（Escherichia coli）DB3.1均由內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存提供。TRIzol試劑、2×Taq PCR Master Mix、pGM-T載體、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;SYBR?Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）購自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。主要儀器設(shè)備：梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）、高速冷凍離心機(jī)（Thermo SCIENTIFIC公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上?！憧茖W(xué)儀器有限公司）和ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo SCIENTIFIC公司）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 材料種植及Cd2+脅迫處理 將本生煙草種植于有機(jī)土與蛭石等體積混合的花盆中，置于溫室中培養(yǎng)。待煙草植株長出4片真葉時(shí)，分別用0（對(duì)照）、250和500 mg/L氯化鎘（CdCl2）溶液澆灌煙草，每周澆灌2次，每次150 mL，2周后分別采集各處理植株葉片0.1 g，用于RNA提取。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 分別將不同濃度Cd2+協(xié)迫處理的本生煙草葉片置于預(yù)冷研缽中，用液氮研磨至粉末狀，按照TRIzol試劑說明提取RNA，用NanoDrop 2000紫外可見分光光度計(jì)測定其濃度，并用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性。以提取的RNA為模板，利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，稀釋5倍后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中本生煙草基因組信息，選取ACT、TUB、PP2A、18S rRNA、GAPDH和EF1a6基因?yàn)楹蜻x內(nèi)參基因，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)其qRT-PCR擴(kuò)增引物（表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 2. 4 內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增 以不同濃度Cd2+協(xié)迫處理的本生煙草葉片cDNA為模板，用6個(gè)內(nèi)參基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各4.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1. 2. 5 重組載體構(gòu)建 參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明切膠回收內(nèi)參基因目的片段，連接至pGM-T載體上，采用熱激法將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DB3.1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選出陽性克隆，提取其質(zhì)粒，利用EcoR I限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切驗(yàn)證為陽性的克隆接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min搖床過夜培養(yǎng)后送上海捷瑞生物工程有限公司測序。

1. 2. 6 內(nèi)參基因qRT-PCR檢測 分別以不同濃度Cd2+處理的本生煙草葉片cDNA為模板對(duì)6個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測，每處理的cDNA模板設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系20.0 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后儀器自動(dòng)讀取數(shù)據(jù)。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2013對(duì)內(nèi)參基因不同稀釋梯度下的循環(huán)閾值（Ct）進(jìn)行整理，計(jì)算Ct均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再利用2-△△Ct法計(jì)算不同濃度Cd2+脅迫下候選基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)6個(gè)內(nèi)參基因在各樣品中的相對(duì)表達(dá)量，分別以geNorm和NormFinder對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析比較，綜合測評(píng)篩選出最佳內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA提取及質(zhì)量檢測結(jié)果

利用TRIzol法提取不同濃度Cd2+脅迫處理的本生煙草葉片總RNA，電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示，28S rRNA條帶亮度約是18S rRNA條帶亮度的2倍，條帶清晰，說明總RNA樣品的完整性較好。核酸定量儀檢測結(jié)果（表2）顯示，總RNA樣品A260/A280約2.00，A260/A230>2.00，平均濃度為1893.3 ng/μL，表明不同濃度Cd2+脅迫處理的本生煙草總RNA提取質(zhì)量和純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)不同濃度Cd2+脅迫處理的本生煙草cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，從不同濃度Cd2+脅迫處理的本生煙草cDNA均擴(kuò)增出目標(biāo)片段，且擴(kuò)增出的ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a內(nèi)參基因長度與預(yù)期結(jié)果基本一致，且特異性較高。圖2為以250 mg/L Cd2+脅迫處理本生煙草cDNA為模板的擴(kuò)增結(jié)果。

2. 3 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證結(jié)果

ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a 6個(gè)內(nèi)參基因重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，均獲得2條條帶，且條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明6個(gè)內(nèi)參基因片段已成功連接至pGM-T載體中。

2. 4 內(nèi)參基因的qRT-PCR檢測結(jié)果

2. 4. 1 內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析結(jié)果

將含內(nèi)參基因的重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋（10-1～10-9）后進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果如圖4所示。內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線走勢正常，平行性好;55～95 ℃熔解曲線僅出現(xiàn)明顯單一峰，表明無引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生，所用引物均能特異擴(kuò)增。

2. 4. 2 內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以重組質(zhì)粒10-1～10-9稀釋梯度的對(duì)數(shù)（起始數(shù)量的對(duì)數(shù)）為x軸、Ct為y軸繪制6種內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），并計(jì)算擴(kuò)增效率E（%）=（10-1/斜率-1）×100，結(jié)果如表5所示。內(nèi)參基因ACT、TUB、18S rRNA、PP2A、GAPDH和EF1a的模板濃度與Ct成反比，各點(diǎn)基本分布在一條直線上，擴(kuò)增效率在要求范圍（90.00%～105.00%）之內(nèi)，符合下一步評(píng)價(jià)的要求，且標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的回歸系數(shù)（R2）>0.9800，說明線性關(guān)系較好。

2. 4. 3 內(nèi)參基因的表達(dá)豐度分析結(jié)果 基因表達(dá)豐度是指基因轉(zhuǎn)錄成mRNA的數(shù)量，基因表達(dá)豐度越高，轉(zhuǎn)錄mRNA的數(shù)量愈多，合成的蛋白也越多。Ct越大，代表基因拷貝數(shù)越低，基因表達(dá)豐度越低。由圖6可知，6個(gè)內(nèi)參基因在0、250和500 mg/L Cd2+脅迫下的表達(dá)水平均存在明顯差異，整體來說，處理組（250和500 mg/L Cd2+脅迫）與對(duì)照組（0 mg/L Cd2+脅迫）存在顯著差異（P<0.05）或極顯著差異（P<0.01），說明Cd2+脅迫處理對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)具有顯著或極顯著影響，以保證后續(xù)數(shù)據(jù)可靠有效，其中，ACT、TUB和PP2A基因的表達(dá)豐度較低，18S rRNA處于中等水平，而GAPDH和EF1a基因的表達(dá)豐度較高，說明GAPDH和EF1a基因適宜作為不同濃度Cd2+脅迫下本生煙草的內(nèi)參基因。

2. 4. 4 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析 利用geNorm程序計(jì)算6個(gè)內(nèi)參基因在不同濃度Cd2+脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定值（M），結(jié)果如圖7所示。6個(gè)內(nèi)參基因的M排序?yàn)?8S rRNA（1.708）>PP2A基因（1.428）>TUB基因（1.368）>ACT基因（1.240）>GAPDH基因（1.228）>EF1a基因（1.140），由于M越低內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定，故EF1a基因表達(dá)最穩(wěn)定，最適宜作為在不同濃度Cd2+脅迫下本生煙草的內(nèi)參基因，其次是GAPDH和TUB基因，而18S rRNA表達(dá)最不穩(wěn)定，最不適合作為內(nèi)參基因。利用NormFinder程序計(jì)算內(nèi)參基因在不同濃度Cd2+脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定值（S），結(jié)果如表6所示。6個(gè)內(nèi)參基因的S排序?yàn)?8S rRNA（1.106）>ACT基因（0.825）>GAPDH基因=PP2A基因（0.696）>TUB基因（0.472）>EF1a基因（0.411），由于S越低，基因表達(dá)越穩(wěn)定，故EF1a基因表達(dá)最穩(wěn)定，最適宜作不同濃度Cd2+脅迫下本生煙草的內(nèi)參基因，而18S rRNA表達(dá)最不穩(wěn)定，最不適合作為內(nèi)參基因，與geNorm程序分析結(jié)果一致。

3 討論

qRT-PCR是檢測基因表達(dá)變化的最佳方法之一（Bustin et al.，2005）。在分析功能性基因表達(dá)之前，必須選擇適宜內(nèi)參基因以控制樣品之間的非特異性變異。在不同生物和生理狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因才可有效用于表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化（Lee et al.，2010）。理論上，理想的內(nèi)參基因應(yīng)在所有細(xì)胞和組織形態(tài)及不同試驗(yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)且不受外界環(huán)境影響（Tong et al.，2009），但目前尚未發(fā)現(xiàn)一個(gè)這樣理想的內(nèi)參基因。已有研究表明，即使內(nèi)參基因在一種物種或組織中穩(wěn)定表達(dá)，但在不同試驗(yàn)條件下也會(huì)表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性（Guénin et al.，2009;Artico et al.，2010）。因此，在分析功能性基因表達(dá)之前，必須事先驗(yàn)證所有內(nèi)參基因，確定其在某些條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性（Bustin，2002;Gutierrez et al.，2008;Guénin et al.，2009）。

本研究選取植物功能性基因研究中常用的6個(gè)內(nèi)參基因，利用geNorm和NormFinder分析其表達(dá)穩(wěn)定性，從而篩選出不同濃度Cd2+脅迫下本生煙草的最佳內(nèi)參基因。其中，geNorm是確定穩(wěn)定內(nèi)參基準(zhǔn)的最佳數(shù)量以精確標(biāo)準(zhǔn)化的簡便方法（Vandesompele et al.，2002），而NormFinder用于評(píng)估geNorm獲得的排名質(zhì)量（Andersen et al.，2004;Pfaffl et al.，2004）。本研究根據(jù)qRT-PCR的Ct進(jìn)行內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析，結(jié)果顯示ACT、TUB和PP2A基因的表達(dá)豐度較低，18S rRNA處于中等水平，GAPDH和EF1a基因的表達(dá)豐度較高，可初步確定GAPDH和EF1a基因可作為Cd2+脅迫下本生煙草的內(nèi)參基因。經(jīng)geNorm和NormFinder對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)EF1a基因表達(dá)穩(wěn)定性最好，因此，EF1a基因是不同濃度Cd2+脅迫下本生煙草的最佳內(nèi)參基因。

4 結(jié)論

EF1a基因在不同濃度Cd2+脅迫處理下表達(dá)水平較高，穩(wěn)定性最好，可作為Cd脅迫下本生煙草的最佳內(nèi)參基因。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 陳 燕）