胡昌亮 尹志剛 俸婷婷 周英

摘 要：構建具有EGFP標簽的抑癌基因p53表達載體，并驗證其對肺癌細胞A549的影響。以質粒pcDNA3.1-p53為模板，設計引物并進行PCR擴增獲得目的基因p53，將獲得的目的基因克隆至載體pcDNA3.1-EGFP上，用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，雙酶切以及測序驗證。將克隆好的載體，利用脂質體法轉染A549細胞，熒光顯微鏡下觀察，同時用MTT法測不同時間段細胞OD值。結果表明，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，目的基因擴增成功。雙酶切及DNA測序結果均證實，成功構建了載體pcDNA3.1-EGFP-p53。轉染A549細胞后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。MTT法測定結果表明，目的基因轉染的A549細胞組所測得的OD值明顯低于對照組（p<0.01）。因此，具有EGFP標簽的抑癌基因p53表達載體pcDNA3.1-EGFP-p53構建成功，轉染A549細胞后，對A549細胞具有一定抑制作用。為后續(xù)繼續(xù)研究p53-MDM2 生物發(fā)光能量共振轉移作用奠定了基礎。

關鍵詞：EGFP;抑癌基因;p53;表達載體;A549細胞

中圖分類號：Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）01-0001-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.001

腫瘤被作為多基因疾病，如果控制細胞分化的基因發(fā)生缺陷或變異，就會導致生長調(diào)節(jié)的失控，加上一連串的變異，包括失去修補基因錯誤的功能以及逃離監(jiān)控錯誤的機制，形成失去秩序的組織等[1]，這些基因可為腫瘤基因，也可為腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)，與人類腫瘤相關性最高的腫瘤抑制基因是p53基因，超過50%的癌癥發(fā)生與其相關[2]，因其編碼一種分子質量大約為53KDa的蛋白質而得名，在DNA轉錄、細胞生長和增殖以及許多代謝過程中有重要作用，能夠有效地對抗組織增生，促進細胞凋亡，具有維持基因組穩(wěn)定、抑制或阻止細胞轉化的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生[3]。

p53位于人體17號染色體上，包含了11個外顯子和10個內(nèi)含子，序列長度大約為20 kb[4]，它編碼的p53蛋白含有393個氨基酸殘基，即被1182 bp基因序列編碼合成。張兆新等[5]利用EGFP熒光報告表達載體構建了BRET模型，從而篩選出抑制p53-MDM2結合的小分子化合物，為治療腫瘤尋找了可能。本文通過將p53抑癌基因克隆至含EGFP的熒光報告基因表達載體上，并將其轉染至肺癌細胞A549中，觀察其是否熒光表達及其對A549細胞的影響，為后續(xù)研究p53-MDM2互作BRET（生物素發(fā)光能量共振轉移）模型，篩選出具有抗腫瘤作用的小分子抑制劑奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株和細胞

pcDNA3.1-p53、pcDNA3.1-EGFP質粒以及大腸桿菌Dh5α 均由本實驗保存。肺癌細胞 A549購于中國昆明細胞庫，細胞培養(yǎng)液為添加了10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液以及1%谷氨酰胺的RPIM1640 培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶購自Takara公司;DNA膠回收試劑盒購自四川成都福際生物有限公司;質粒小提取試劑盒購于天根生物;去內(nèi)毒素質粒中提試劑盒購自OMEGA;LipofectamineTM 3000轉染試劑、Taq DNA聚合酶、dNTP購自Takara公司;RIPM1640培養(yǎng)基購自Gibico公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

PCR擴增儀、穩(wěn)壓電泳儀及電泳槽（美國 Bio-Rad公司）;超低溫高速離心機（Eppendoff 公司）;CO2 培養(yǎng)箱（3111，Thermo Fisher Scientific）;倒置熒光顯微鏡（徠卡）;微波爐（美的）;多功能酶標儀（Thermo Fisher Scientific Oy）;超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司）等。

1.4 引物設計與合成

根據(jù)NCBI中p53基因序列，應用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，5’端分別添加Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點，由上海英駿公司合成。

上游引物：5’-CCCAAGCTTATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT

下游引物：5’-CGCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG 。

1.5 pcDNA3.1-EGFP-p53表達載體構建

獲取目的基因：利用質粒小提取試劑盒對含pcDNA3.1-p53菌液進行質粒提取，以此質粒作為PCR擴增模板。擴增體系為：模板DNA（10 pg-30 ng）10 μM，上下游引物各2 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，ddH2O補至50 μL;反應程序：95℃預變性30 s;95℃變性15 s，63℃退火15 s，72℃延伸60 s，34次循環(huán);72℃徹底延伸5 min，終止反應。

基因克?。耗z回收純化PCR產(chǎn)物，用Takara快切酶進行雙酶切，再次膠回，得到最終連接所需目的基因產(chǎn)物，并將其克隆到載體pcDNA3.1-EGFP上。按照以下體系進行連接反應：10×ligation buffer 2 μL，載體DNA 50 ng，目的基因p53（與載體DNA的摩爾比約為3），T4 DNA Ligase（350U/μL）1 μL，滅菌水補至20 μL，4℃過夜反應，取部分連接液進行轉化。挑取單菌落進行液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后菌落PCR和提取質粒雙酶切驗證，得到陽性克隆菌液送至上海英駿公司進行測序。

1.6 利用脂質體法將pcDNA3.1-EGFP-p53質粒轉染A549細胞

采用LipofectamineTM 3000法轉染真核細胞A549，該方法避免了后續(xù)細胞培養(yǎng)需要更換無血清培養(yǎng)基。按試劑盒操作說明書進行，轉染前用胰酶消化細胞，用適量完全培養(yǎng)基按2.5×105個細胞/孔的密度平鋪于6孔板，置于含有5%CO237℃的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞至70%～90%匯合度時轉染。將6孔板分為三組，分別是空白對照組（不進行任何轉染）、陰性對照組（轉染空載體pcDNA3.1-EGFP）、實驗組（含目的基因pcDNA3.1-EGFP-p53質粒）。轉染完成后24 h開始在熒光顯微鏡下觀察各組熒光情況[6]。

1.7 MTT法檢測pcDNA3.1-EGFP-p53質粒轉染A549細胞12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h后的影響

（1）復蘇培養(yǎng)A549細胞，保持細胞狀態(tài)良好;（2）接種細胞5×104個/孔密度于24孔板中，每孔加入400 μL（設3個復孔），按上面的方法分為三個實驗組，至70%～90%匯合度時轉染;（3）參照LipofectamineTM 3000操作說明和要求進行轉染實驗;（4）分別在轉染12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h后，每孔加入50 μLMTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h后，在顯微鏡下觀察到結晶體，棄掉上清液，加入400 μL DMSO溶液;（5）37℃搖床上緩慢搖10 min，待晶體溶解;（6）實驗組和對照組每孔分三個，分裝到96孔板的小孔里，使用酶標儀，在490 nm 處檢測吸光度[6]。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 22.0 軟件進行處理。計量資料均用均數(shù)±標準差（X±S）表示。兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，檢驗水準：P <0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 p53基因的PCR擴增與鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，挑取的3個單菌落做菌落PCR均在約1200 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期大小（1182 bp）大小一致，初步說明目的基因已連接到目的載體上且轉化成功。

2.2 重組載體pcDNA3.1-EGFP-p53的雙酶切鑒定

經(jīng)過雙酶切表明，出現(xiàn)1182 bp和超過2000 bp（載體大小為6119 bp）兩條條帶，與預期目的片段大小一致，進一步表明此重組載體構建成功，將陽性質粒送公司測序后經(jīng)NCBI BLAST后，結果為目的片段。

2.3 質粒pcDNA3.1-EGFP和質粒pcDNA3.1-EGFP-p53轉染A549細胞后熒光顯微鏡下不同時間段觀察結果

轉染后，能清晰的觀察到對照組有明顯的綠色熒光產(chǎn)生，說明空載體轉染成功。與對照組相比，實驗組綠色熒光相對較弱，通過觀察熒光，檢測p53基因是否成功轉入A549細胞，還能觀察到不同時間段p53對A549細胞增殖的作用。在24 h開始出現(xiàn)微弱綠色熒光，可能由于轉染時間較短造成。在36 h開始熒光強度逐漸增強，其中48 h時達到了最強，后又逐漸變?nèi)?，由此可以說明目的質粒轉染成功。

2.4 MTT法測pcDNA3.1-EGFP-p53轉染A549細胞后不同時間段OD值變化

轉染pcDNA3.1-EGFP-p53質粒的細胞株和對照組的OD值變化表明：獲得性表達外源p53基因的A549細胞，從24 h開始，其生長速度明顯低于轉染含EGFP空載體對照組（P <0.01），其生長明顯受到抑制。轉染的空載體和含p53基因目的質粒從24 h開始檢測起，均與空白細胞組呈顯著性差異（P <0.01）。

3 結論與討論

本實驗以肺癌細胞A549作為研究對象，成功構建具有EGFP標簽的抑癌基因p53表達載體，通過熒光顯微鏡觀察到，在轉染pcDNA3.1-EGFP和pcDNA3.1-EGFP-p53的A549細胞中均可觀察到綠色熒光。但由于構建的目的載體中抑癌基因p53位于EGFP上游，所以pcDNA3.1-EGFP-p53的熒光比pcDNA3.1-EGFP的熒光弱。通過MTT法測得不同時間段p53對肺癌細胞A549的影響（P <0.01），與對照組相比，初步說明p53對A549具有一定抑制作用。為后續(xù)深入研究尋找激活p53小分子化合物構建p53-MDM2互作BRET模型奠定了基礎。

p53與EGFP融合表達，作為目前熒光報告基因研究的熱點[7]，可以通過熒光觀察判斷目的基因是否表達，無需損傷細胞即可研究細胞內(nèi)事件增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為應用最多的發(fā)光蛋白，510 nm處左右自行發(fā)射綠色熒光，無需輔助因子和底物，適于基因轉錄動力學研究和高通量篩選，尤其適用于基因轉移的定性研究。綠色熒光的激發(fā)波長為藍光波長，因此可用藍光波長激發(fā)綠色熒光，觀察其表達情況。

癌癥是當今世界嚴重威脅人類生活水平和人類健康的主要原因之一，也是困擾了人們多年的生物學和醫(yī)學難題[8]。研究發(fā)現(xiàn)，p53作為控制保護細胞惡性轉移主要通路的腫瘤抑制因子，具有抑制或阻止細胞增殖和轉化、維持基因組穩(wěn)定的功能;mdm2 是 p53 的主要調(diào)節(jié)因子，其表達產(chǎn)物 MDM2 蛋白可與 p53蛋白結合而抑制 p53 的正常生物學功能，從而誘導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前以研究p53-MDM2作為癌癥治療的一個新靶點，胡純琦[1]、李翔[9]等課題組利用此靶點進行了小分子抑制劑的篩選，其主要使用的是熒光偏振作用篩選。本課題為了更好尋找抑制p53-MDM2結合的小分子試劑，提出了構建p53-MDM2互作的BRET模型[10-14]，其中p53-EGFP融合表達是關鍵一步，為后續(xù)高效篩選小分子化合物提供了基礎。

參 考 文 獻：

[1] 胡純琦.p53-MDM2結合抑制劑的設計、合成及生物學活性評價[D].杭州：浙江大學，2012.

[2] 李洪斌.Slug對P53-MDM2系統(tǒng)的調(diào)控作用[D].天津：河北工業(yè)大學，2011.

[3] 王 炎，李 琦，范忠澤，等.丹參酮ⅡA介導p38MAPK信號轉導誘導人肝癌細胞凋亡[J].世界華人消化雜志，2009，17（2）：124-129.

[4] Vogelstein B，Lane D，Levine A J.Surfing the p53 network[J].Nature，2000，408（6810）：307-310.

[5] 張兆新.p53-mdm2相互作用小分子抑制劑的篩選[D].上海：華東師范大學，2014.

[6] 寶梅英.在A549細胞中重組表達具有EGFP標簽的抑癌因子LKB1及對細胞生長和p53蛋白水平的影響[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學，2012.

[7] 郭學雙.含雙熒光報告基因的轉基因載體的應用[D].蘇州：蘇州大學，2010.

[8] De P M，Venneri M A，Roca C，et al.Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells[J].Nature Medicine，2016，9（6）：789-795.

[9] 李 翔.1.p53-MDM2/MDMX相互作用抑制劑的設計、合成與表征2.新型糖基化多肽的合成、表征及抗體制備[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2017.

[10] Hübner G M，Larsen J N，Guerra B，et al.Evidence for aggregation of protein kinase CK2 in the cell：a novel strategy for studying CK2 holoenzyme interaction by BRET 2[J].Molecular & Cellular Biochemistry，2014，397（1-2）：285.

[11] 郭曉令，余榕捷，鐘佳萍，等.熒光互補與光能量共振轉移檢測B類G蛋白偶聯(lián)受體PAC1二聚化[J].中國細胞生物報，2012，34（10）：1023-1029.

[12] 杜 輝，白 波，陳 京.BRET技術在G蛋白偶聯(lián)受體與β-arrestins相互作用研究中的應用進展[J].第二軍醫(yī)大學學報，2011，32（10）：1140-1143.

[13] 李雅林，白 波，陳 京.生物發(fā)光共振能量轉移技術及其應用[J].中國生物化學與分子生物學報，2009，25（12）：1077-1082.

[14] Le N C H，Gel M，Zhu Y，et al.Real-time，continuous detection of maltose using bioluminescence resonance energy transfer （BRET）on a microfluidic system[J].Biosensors & Bioelectronics，2014，62（20）：177-181.