唐艷 武曉曉 婁兵海 劉萍 陳傳武 牛英 張戈壁 燕佳文 鄧崇嶺

摘要：【目的】研發(fā)一種快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質材料的方法，為加快柑橘黃龍病耐性育種進程和提高育種效率打下基礎?！痉椒ā恳允占?6份疑似對柑橘黃龍病具有耐性的柑橘種質為材料，采用直接高接于感染黃龍病菌柑橘樹上的方法（高接染毒鑒定法），通過田間癥狀觀察結合定量PCR檢測對試驗材料的耐病性進行鑒定評價?！窘Y果】春季高接供試材料1個月后接芽萌發(fā)，3個月后（2018年6月5日）首次在KH-14上出現典型的葉片斑駁型黃化癥狀，4個月后（2018年7月5日）觀察有23份種質材料的葉片出現斑駁型黃化癥狀，另外11份種質材料未表現癥狀;6個月后（2018年9月4日）觀察發(fā)現KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份種質材料的生長雖然較正常，但葉片已出現黃化癥狀，只有KH-21的枝梢生長良好，無黃梢和斑駁型黃化葉，初步判定為對黃龍病具有耐性的種質材料。對6份種質材料的定性PCR檢測結果表明，KH-21為陰性，其他5份材料為陽性;實時熒光定量PCR檢測結果，KH-21的平均黃龍病菌含量為1870.0個細胞/μg DNA，對照材料平均黃龍病菌含量為372285.5個細胞/μg DNA，表明KH-21對柑橘黃龍病具有耐性。【結論】高接染毒鑒定法鑒定周期在6個月左右，具有通量大、時間短、效率高、成本低及結果準確等優(yōu)點，能達到快速鑒定柑橘品種對柑橘黃龍病耐性的目的，可在柑橘黃龍病耐性鑒定中推廣使用。

關鍵詞： 柑橘;黃龍病;耐性;種質材料;高接染毒鑒定法

中圖分類號： S436.661.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2489-07

A rapid identification method for germplasm materials resistant to citrus Huanglongbing disease

TANG Yan1， WU Xiao-xiao1， LOU Bing-hai1， LIU Ping1， CHEN Chuan-wu1，

NIU Ying1， ZHANG Ge-bi1， YAN Jia-wen2， DENG Chong-ling1*

（1Guangxi Academy of Specialty Crops/Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology， Guilin， Guangxi? 541004， China; 2College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin， Guangxi? 541004， China）

Abstract：【Objective】To develop a rapid identification method for citrus Huanglongbing disease resistant germline materials and provide basis for accelarating the citrus breeding that were resistant to Huanglongbing and increasing the breeding efficiency. 【Method】Thirty-six citrus germplasms suspected to be resistant to citrus Huanglongbing disease were collected in this study. The method of direct high grafting to citrus trees infected with Huanglongbing pathogen was adop-ted. The resistance of the test materials was identified and evaluated by field symptoms combined with quantitative PCR. It was defined as the top grafting identification method. 【Result】The test materials that were grafted in spring started to germinate after one month， and three months later（June 5， 2018），typical mottled yellowing on leaves was observed on KH-14 for the fiest time. After four months（July 5， 2018） of top grafting， typical mottled yellowing occurred on 23 mate-rials， and 11 materials showed no such symptom. After six months（September 4， 2018） of top grafting， although the growth of KH-18，KH-12， KHY-4， KHY-5 and KHY-6 were normal， yellowing was observed on their leaves. Only KH-21 grew well， and showed no yellow shoots and yellowing leaves. It was identified as the material with resistance to Huanglongbing disease. Quantitative PCR tests on the above six materials showed that KH-21 was negative and the other five were positive. Real-time fluorescence quantitative PCR test indicated that the average Huanglongbing bacteria amount in KH-21 was 1870.0 cell/μg DNA， and the average Huanglongbing bacteria amount incontrol material was 372285.5 cell/μg DNA， indicating KH-21 was resistant to Huanglongbing bacteria. 【Conclusion】The method for infecting bacteria by topgrafting takes six months， and can detect large amount of seedlings，it is time-saving， high efficient，low-cost and accurate. This methodcan quickly identify the resistance of citrus varieties to citrus Huanglongbing disease， and can be popularized and used in the identification of citrus Huanglongbing disease resistance.

Key words： citrus; Huanglongbing disease; resistance; germplasm material; method for infecting bacteria by top grafting

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing）是一種世界范圍的柑橘毀滅性細菌病害，其病原是一類難培養(yǎng)的革蘭氏陰性細菌（Bassanezi et al.，2009;鄧崇嶺，2017），目前已發(fā)現3個種：亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲種（Ca. L. africanus）（Jagoueix et al.，1994）和美洲種（Ca. L. americanus）（Teixeira et al.，2005;Bové，2006），其中亞洲種發(fā)生流行最廣泛，在我國發(fā)生流行的也是亞洲種。黃龍病每年對我國柑橘產業(yè)造成的經濟損失高達數十億元。柑橘樹感染黃龍病初期，植株新抽出的枝梢葉片接近成熟時停止轉綠，在樹冠頂部形成明顯的“黃梢”，受害葉片主要表現為斑駁型黃化、均勻型黃化和花葉型3種類型癥狀。黃龍病樹經過2～3年的病情發(fā)展，全樹發(fā)黃，樹勢迅速衰退，葉片早脫落，枝梢干枯，根系腐爛，病株逐漸枯死。柑橘植株一旦感病，輕者影響產量和品質，重者則造成樹死園毀，給果農帶來不可估量的經濟損失（婁兵海和周常勇，2007;程春振等，2013;周常勇，2018）。目前，柑橘黃龍病的綜合防控措施主要有種植柑橘無病苗木、防治柑橘木虱、及時清除病樹（鄧秀新和彭抒昂，2013）等，雖然嚴格執(zhí)行上述措施能有效防控柑橘黃龍病，但在實際生產中存在一定的操作執(zhí)行難度。因此，篩選出對柑橘黃龍病具有抗性或耐性的柑橘種質材料或新品系，并在生產上推廣應用，是解決柑橘黃龍病危害最根本的途徑，對柑橘產業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，部分野生柑橘品種對黃龍病具有一定的耐性，但由于供試野生柑橘品種數量少，迄今為止，國際上尚未挖掘出更有耐黃龍病價值的柑橘資源。廣西存在大量的野生和特有柑橘種質資源，石健泉（1989）、鄧崇嶺等（2013）先后開展了廣西柑橘種質的調查、收集和保存工作，目前已在廣西特色作物研究院保存了575份柑橘種質資源，其中廣西野生和特有柑橘種質資源81份，同時從大田中優(yōu)選出疑似耐黃龍病種質材料62份，這些資源中可能存在具有柑橘黃龍病耐性的柑橘種質材料。然而，目前對柑橘黃龍病耐性柑橘種質材料的常用鑒定方法是將待鑒定種質材料嫁接到砧木上培育成幼苗，然后將感染黃龍病的芽、皮或枝段嫁接到幼苗上，使黃龍病菌傳染到待鑒定的種質材料上，再通過黃龍病典型癥狀的表現及PCR檢測情況判斷該種質材料對柑橘黃龍病的耐性（黃小耘和田甜，2015;李彬，2019），鑒定周期較長，且存在接種病原數量少、效率低、成本高等缺點。【本研究切入點】鑒于此，有必要研發(fā)一種可快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質材料的方法，以解決現有技術的不足?！緮M解決的關鍵問題】研發(fā)一種可快速鑒定柑橘黃龍病耐性種質材料的方法，為加快柑橘黃龍病耐性育種進程和提高育種效率打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料共36份，為2014—2018年在廣西調査、發(fā)掘和收集的疑似對柑橘黃龍病具有耐性的柑橘種質材料（表1）。36份種質材料分別嫁接在枳砧上，種植于廣西特色作物研究院柑橘育種大棚內加以保存，目前生長情況較好，可滿足接穗采集和嫁接使用。

1. 2 傳（染）毒鑒定方法比較試驗

1. 2. 1 嫁接傳毒鑒定法（常規(guī)方法） 2017年9月，將收集的3份待鑒定沙糖橘種質材料KH-16、KH-17和KH-18取單芽采用小芽腹接法嫁接在枳砧上，于2018年3月剪去嫁接口以上的砧木枝干，至2018年9月抽發(fā)的嫁接芽長成小苗;同時，設沙糖橘無病苗為對照。2018年9月從沙糖橘黃龍病樹上表現斑駁型黃化葉片癥狀的枝條上采集接穗，采用腹接法，嫁接到待鑒定的種質材料上，每株均嫁接3個黃龍病病樹芽。對供試材料及對照定期進行黃龍病癥狀觀察，并在嫁接傳毒6個月后進行定性和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。

1. 2. 2 高接染毒鑒定法 2018年3月將相同的3份待鑒定沙糖橘種質材料取單芽高接至黃龍病樹上，成活后定期進行黃龍病癥狀觀察，并在6個月后進行定性和實時熒光定量PCR檢測;同時，將無毒沙糖橘芽高接至同一株黃龍病樹上作為對照。

1. 3 高接染毒鑒定試驗

1. 3. 1 高接樹選擇 在柑橘果園中選取感染黃龍病菌的柑橘樹，并進行PCR檢測加以確定。本次試驗果園位于廣西桂林市臨桂區(qū)中庸鄉(xiāng)江勒寨村。園中所種柑橘品種為沙糖橘，砧木為枳，共計112株，經PCR檢測，112株樹全部呈陽性，田間癥狀觀察和PCR檢測結果表明，所選的高接樹均已感染黃龍病（圖1）。

1. 3. 2 高接染毒鑒定試驗 于2018年3月將供試材料高接至黃龍病樹上。高接供試種質材料36份，其中2份材料由于天牛危害死亡，因此高接鑒定材料實為34份，高接方法為春接。

高接方法主要分為春接和秋接。春接：接種時間為2—4月，高接方式為單芽切接;操作方法：在高接樹上選取直徑0.5 cm以上的枝條，在樹皮平滑處剪斷，在枝條斷面下方沿皮層與木質部交界處向下縱切一刀，露出形成層，切面短于接穗芽，然后從待鑒定種質材料的枝條上切取單芽，將單芽插入中間砧枝條切口上，對準雙方形成層并縛緊。秋接：接種時間為9—11月，高接方式為小芽腹接;操作方法：在高接樹上選取直徑0.5 cm以上的枝條，在樹皮平滑處沿皮層與木質部交界處向下縱切一刀，露出形成層，切面長度2.0～4.0 cm，然后從待鑒定種質材料的枝條上切取芽片，將芽片插入砧枝條切口上并縛緊，保留高接枝條。同時設同一品種的對照品種進行高接。

1. 3. 3 田間癥狀觀察 高接4個月后，根據待鑒定種質材料抽出枝梢的癥狀進行診斷：枝梢生長良好、無黃梢、無斑駁型黃化葉或僅有輕微葉片黃化癥狀，則初步判定該種質材料對柑橘黃龍病具有耐性;枝梢生長較弱、黃梢嚴重、葉片斑駁型黃化癥狀明顯，則初步判定該種質材料對柑橘黃龍病不具耐性。

1. 3. 4 實時熒光定量PCR檢測 取高接成活且初步判定為對柑橘黃龍病具有耐性種質材料的葉片，采用改良CTAB法提取DNA（程運江等，2001），得到待測樣品的DNA模板;從健康柑橘樹的葉片中提取DNA作為陰性對照，從柑橘黃龍病樹的葉片中提取DNA作為陽性對照;參照Li等（2006）的方法進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線，并建立標準曲線方程，計算病原菌含量。

2 結果與分析

2. 1 兩種鑒定方法結果

對3份沙糖橘種質材料KH-16、KH-17和KH-18進行田間癥狀觀察，結果顯示，采用嫁接傳毒法的植株在接種毒源6個月后均表現出典型的葉片斑駁型黃化癥狀;采用高接染毒法的植株在高接3個月后開始出現黃龍病典型葉片黃化癥狀，4個月后黃龍病典型斑駁型葉片黃化癥狀明顯。

對3份沙糖橘種質材料分別進行定性和實時熒光定量PCR檢測，結果（表2）顯示，采用嫁接傳毒法的材料黃龍病菌平均含量為1079608.0個細胞/μg DNA，采用高接染毒法的材料黃龍病菌平均含量為1269969.7個細胞/μg DNA，較嫁接傳毒法的病菌平均含量約高17.63%。

嫁接傳毒鑒定法（常規(guī)方法）是在待鑒定種質上嫁接已感染黃龍病的芽、皮或枝段，使黃龍病菌傳染到待鑒定的種質材料上，嫁接材料由于體積小，含有的病原數量較少，使得接種病原數量少，鑒定周期為10～16個月。高接染毒鑒定法是將待鑒定的種質材料直接高接在柑橘黃龍病樹上，病原數量多且可持續(xù)侵染待鑒定的種質材料，高接成活后通過黃龍病癥狀觀察結合黃龍病菌PCR定量檢測進行耐性鑒定，鑒定周期為6個月。兩者相比較，高接染毒鑒定法具有通量大、時間短、效率高、成本低及結果準確等優(yōu)點。

2. 2 高接柑橘成活率調查結果

2018年7月31日，對高接試驗果園的嫁接成活情況進行觀察統(tǒng)計，高接芽共計397個，其中成活芽357個，成活率為89.92%。

2. 3 高接后田間癥狀觀察結果

春季高接鑒定材料1個月后接芽萌發(fā)，2個月后接芽生長正常，3個月后開始出現黃龍病典型葉片黃化癥狀，4個月后黃龍病典型斑駁型葉片黃化癥狀明顯（圖2），可進行黃龍病田間癥狀觀察和統(tǒng)計，同時進行黃龍病菌定性PCR檢測（圖3）。2018年6月5日首次出現典型的葉片斑駁型黃化癥狀，種質材料編號為KH-14（宮川）;6月19日觀察發(fā)現9份種質材料的葉片出現斑駁型黃化癥狀;7月5日觀察23份種質材料的葉片出現斑駁型黃化癥狀，另外11份種質材料未表現癥狀;8月7日觀察只有6份種質材料（KH-21、KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6）的葉片未表現癥狀，其余材料出現葉片斑駁型黃化癥狀，說明34份種質材料對柑橘黃龍病的耐性存在差異;9月4日觀察KH-18、KH-12、KHY-4、KHY-5和KHY-6等5份種質材料的生長雖然較正常，但葉片已出現黃化癥狀（非黃龍病典型斑駁型黃化癥狀），疑似感染黃龍病病菌，只有編號為KH-21材料（沙糖橘）的枝梢生長良好，無黃梢和斑駁型黃化葉，初步判定為對黃龍病具有耐性的種質材料。對照同一品種則已表現出典型的黃龍病癥狀，即枝梢生長較弱、黃梢嚴重、葉片斑駁型黃化癥狀明顯，初步判定為對黃龍病不具耐性的種質材料。

2. 4 定量PCR檢測結果

2018年9月7日，對8月7日觀察的6份未表現黃龍病癥狀的種質材料進行定性PCR檢測，結果表明，KH-21材料檢測結果為陰性，其他5份材料檢測結果為陽性，雖然5份材料已感染黃龍病菌，但其枝梢生長較正常、生長勢較旺，感染時間也較晚，說明對黃龍病有一定的耐病性。2018年9月12日對定性PCR檢測呈陰性的KH-21材料進行實時熒光定量PCR檢測，結果表明，KH-21材料中的黃龍病菌含量為1809.0個細胞/μg DNA，對照材料黃龍病菌含量為951837.0個細胞/μg DNA（圖4）;此后，在不同時期連續(xù)進行5次實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，KH-21平均黃龍病菌含量為1870.0個細胞/μg DNA，對照材料平均黃龍病菌含量為372285.5個細胞/μg DNA ，對照含菌量是KH-21的199.1倍，說明KH-21材料中的黃龍病菌含量明顯低于對照（圖5）。

2. 5 田間癥狀結合實時熒光定量PCR檢測對耐性種質的評價

實時熒光定量PCR檢測及田間癥狀觀察結果顯示，編號為KH-21材料的枝梢生長良好，在試驗果園內未觀察到黃梢和葉片斑駁型黃化癥狀，且實時熒光定量PCR檢測結果表明黃龍病菌含量為1809.0個細胞/μg DNA，表明KH-21對柑橘黃龍病具有耐性。

3 討論

盡管黃龍病病原可感染所有柑橘主栽品種，且目前還未發(fā)現抗性資源和材料，但已有研究發(fā)現，不同柑橘品種對黃龍病的耐性不同，寬皮橘（C. reticulata）、甜橙（C. sinensis）和桔柚（C. reticulata×C. paradisi）最感病，檸檬（C. limonum）和葡萄柚（C. paradisi）較耐病，枳殼（Poncitrus. trifoliate）、來檬（C. aurantifolia）和枳橙（C. sinensis×P. trifoliate）最耐?。S麗，2013）;胡柚、金柑和佛手較抗病，椪柑和甌柑等較易感?。ㄊY自珍等，2006）。Shokrollah等（2011）通過柑橘嫁接試驗證明，依據植株黃龍病癥狀可將供試材料分為5組：重癥組，包括寬皮柑橘、甜橙和印度酸橘;中癥組，包括金柑、阿力檬和小花大翼橙;輕癥組，包括枸櫞、部分來檬和粗檸檬等;耐病組（無黃龍病癥狀，但有黃龍病菌檢出），包括酸橙和某些來檬;抗病組（無癥狀且黃龍病菌檢測陰性），包括Limau Bali柚、馬蜂柑和Limau Tembikai。林雄杰等（2014）測試13個枳屬及其雜交種砧木對黃龍病的抗性，結果所有供試砧木品種均表現出黃龍病癥狀，其中LT49、5號小花枳、墨西哥枳橙、LT54和鄢陵枳橙等5個品種接穗上的黃龍病癥狀表現較嚴重。劉登全等（2014）采用黃龍病毒源樹對不同柑橘品種進行嫁接，結果表明，椪柑高度感病，琯溪蜜柚次之，溫州蜜柑高度抗病。McCollum等（2016）通過長期田間評估發(fā)現，大部分柑橘品種均易感染黃龍病，而澳沙檬和澳指檬等柑橘近緣屬植物對黃龍病具有一定的抗/耐病性。以上研究均表明，不同柑橘品種對黃龍病的耐性存在差異。

目前，對柑橘黃龍病耐性種質材料的鑒定方法通常是嫁接傳毒鑒定法，該方法的主要缺點是每份待鑒定材料只能通過嫁接來接種病原，由于嫁接材料體積小，含有的病原數量較少，使得接種病原數量少;此外，由于鑒定周期通常在10～16個月，時間長、效率低、成本高。本研究首次將待鑒定的種質材料直接高接在柑橘黃龍病病樹上，高接成活后通過黃龍病癥狀觀察，并結合黃龍病菌定量PCR檢測進行耐性鑒定，即高接染毒鑒定法，目前國內外未見有類似報道。高接染毒鑒定法克服了現有技術的不足，提供了一種對柑橘黃龍病具有耐性的種質材料的快速鑒定方法：每份待鑒定種質材料直接嫁接在柑橘黃龍病病樹上，病原數量多且可持續(xù)侵染待鑒定的種質材料;鑒定周期在6個月左右，具有通量大、時間短、效率高、成本低及結果準確等優(yōu)點。

4 結論

本研究將待鑒定的種質材料直接高接于柑橘黃龍病病樹上進行耐性鑒定，即高接染毒鑒定法，能達到快速鑒定柑橘品種對柑橘黃龍病耐性的目的，為開展柑橘黃龍病耐性育種和耐病分子機制研究打下一定基礎，可在柑橘黃龍病耐性鑒定中推廣使用。

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（責任編輯 麻小燕）