王曉慧 于海亮 鄒文斌 糜長浩 戴國俊 張濤 張跟喜 謝愷舟 王金玉 施會強

摘要：【目的】研究白介素8（1L-8）基因5'調控區(qū)單核苷酸突變對雞柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）抗性指標的影響。【方法】本試驗利用DNA直接測序技術，檢測京海黃雞IL-8基因5'調控區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNPs），并對5'調控區(qū)的SNPs突變前后的轉錄因子進行預測，然后分析SNPs與柔嫩艾美耳球蟲抗性指標的關聯(lián)性。【結果】測序結果表明：IL-8基因5'調控區(qū)共檢測到3個突變位點（T-550C、G-398T和T-360C），均形成了3種基因型，雜合度在0.4360.471，PIC值在0.250.50，均屬于中度多態(tài)，且3個突變位點均處于哈代一溫伯格平衡狀態(tài)。生物信息學分析表明：3個突變位點均改變了其原有的轉錄因子結合位點。關聯(lián)分析顯示：T-550C突變位點的TC型個體的IL-8表達量與TT型差異顯著，TC型GSH-PX、CAT、IL-2、IL-6、IFN-γ指標均高于其他2種基因型，但差異不顯著。G-398T突變位點的TT型個體SOD活性和GT型個體CAT活性均顯著高于GG型;TT型個體NO含量與GG型差異極顯著，與GT型差異顯著;TT型IL-2表達量顯著高于GT型。T-360C突變位點的TT型和TC型個體SOD活性與CC型差異極顯著或差異顯著;TT型和TC型個體的NO含量均顯著高于CC型;TT型個體的IL-2、IL-8表達量均顯著高于CC型?！窘Y論】G-398T和T-360C突變位點的 TT型個體球蟲抗性優(yōu)于其他基因型個體，T-550C突變位點的雜合型個體球蟲抗性優(yōu)于純合型個體，表明IL-8基因5'調控區(qū)的突變對球蟲抗性指標有顯著的調控作用，可作為球蟲病抗性雞新品種或新品系的育種參考依據(jù)。

關鍵詞：京海黃雞;柔嫩艾美耳球蟲;白介素8基因;5'調控區(qū)SNPs;抗性指標

中圖分類號：S831.2 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）11-1262-08

0 引言

【研究意義】球蟲病是由原生動物寄生蟲引起的一種重要的腸道疾病，可導致家畜體重下降、營養(yǎng)不良、失血、脫水和對其他疾病因子的易感性增加，降低動物生產性能，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失[1-2]。雞對艾美耳球蟲屬易感，寄生于盲腸的柔嫩艾美耳球蟲感染尤為嚴重，病理表現(xiàn)為腸道黏膜損傷、盲腸腫脹、出血及排出血便[3-4]。迄今為止，藥物防治和活疫苗是兩種主要的球蟲病控制策略[5]，但抗球蟲藥和接種疫苗會引起雞只的藥物殘留、抗藥性及蟲株變異等風險[6]。因此在分子水平上研究球蟲病抗性基因，通過遺傳選育、培育抗病品種是解決這一問題的有效途徑?！厩叭搜芯窟M展】白介素8（IL-8）是一種趨化性細胞因子，一方面能激活嗜中性粒細胞，誘導中性粒細胞釋放溶酶體酶，清除病原菌[7]，另一方面參與免疫反應，實現(xiàn)免疫細胞的抵抗功能，促進傷口愈合[8]。Cornelissen等[9]研究表明IL-8能夠有效地招募Thl CD4⁺、巨噬細胞和單核細胞，進而誘導IFN-γ的產生。Swaggerty等[10]通過連續(xù)3個世代選擇外周血白細胞促炎性細胞因子白介素6（IL-6）、IL-8和趨化因子CCLi2的高水平表達（非球蟲感染）的肉雞個體進行配種，發(fā)現(xiàn)其后代柔嫩艾美耳球蟲的抵抗能力極顯著高于低表達水平群體。陳仁金等[11]采用混合動物模型將IL-8基因遺傳多態(tài)性與荷斯坦奶牛7個性狀進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)ILS基因連鎖突變對荷斯坦牛泌乳性狀以及抗病性狀有較大的遺傳效應，可用于中國荷斯坦牛的分子標記輔助選擇。林雨鑫等[12]采用RNA-seq技術對E.tenella感染雞和非感染對照雞的盲腸組織進行轉錄組分析，篩選到許多顯著富集的通路和差異表達基園，主要有IL-6、IL-8、IL-12β、IL-15、IL-17和TGFB2等。辛世杰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，IL-8基因在感染柔嫩艾美耳球蟲的京海黃雞脾臟和盲腸組織中表達量顯著升高，表明IL-8基因在雞球蟲感染中發(fā)揮一定的作用?！颈狙芯壳腥朦c】雖然已有研究發(fā)現(xiàn)IL-8參與免疫應答、具有誘導中性粒細胞釋放溶酶體酶和清除病原體等作用，但關于IL-8基因5'調控區(qū)單核苷酸多態(tài)性對球蟲抗性指標的影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本試驗采用DNA直接測序技術，檢測京海黃雞IL-8基因5'調控區(qū)單核苷酸多態(tài)性（SNPs），并對5'調控區(qū)的SNPs突變前后轉錄因子進行預測，同時還分析這些SNPs與球蟲抗性指標的關聯(lián)性，旨在篩選與京海黃雞柔嫩艾美耳球抗性選育有利的突變基因型，為培育球蟲病抗性新品種或新品系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選購江蘇省海門集團1日齡京海黃雞共92只，公母各半，飼養(yǎng)于無病原的雞舍中，所食飼料中不含任何球蟲及抗球蟲性藥物，試驗雞預試期內經糞檢無球蟲。E.tenella孢子化卵囊為揚州大學獸醫(yī)學院寄生蟲教研室保存蟲種，經非球蟲免疫健康雞體內傳代一次后收集獲得。

1.2 樣本處理及采集

30日齡時，每只雞灌飼1.5萬個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊。記錄感染期間0～8d體增重。在感染后的第8d翅靜脈采血，肝素鈉抗凝，立即4000r·min^-1離心5min，分離血漿和血細胞后于-20℃冰箱中保存。

1.3 基因組DNA提取及檢測

根據(jù)文獻[8]的方法提取所有試驗雞的全血基因組DNA，用微量紫外可見光分光光度計對基因組DNA進行OD值以及濃度測定，經測定所提取的DNA樣品OD_260nm/OD_280nm值在1.8～2.0，質量濃度在500～1000μg·μL^-1，均符合試驗要求。將合格樣品稀釋至100ng·μL^-1，4℃或-20℃（長期）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計及PCR擴增

根據(jù)GenBank中已公布的雞IL-8基因序列（GeneID：396495），使用Primer Premier 5.0對IL-8基因上游-2000 by至-1bp的核苷酸序列共設計4對引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物設計詳細信息見表1。

PCR反應體系：10μL的2×Taq Master Mix，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，最后加入水補足至20μL體系。PCR擴增程序：95℃預變性5min;95℃變性30s，引物最佳退火溫度退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán);72℃延伸10min，4℃保存。

1.5 基因測序

PCR產物送至上海生物工程技術服務有限公司進行測序。使用儀器為ABI測序儀（3730x1DNA Ana-lyzer）。DNA序列拼接后，用MEGA6.06和DNA-MAN5.2軟件對測序結果進行比對分析，并確定京海黃雞IL-8基因的SNPs。

1.6 轉錄因子預測

使用在線軟件AliBaba2.1（http：//gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）進行預測IL-8基因5'調控區(qū)核苷酸序列突變后可能存在的轉錄因子結合位點和可能結合的轉錄因子。

1.7 抗性指標測定

血漿抗氧化指標按試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明書采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法測定[13-14]，測定指標包括：超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮（NO）、白介素1-β（IL-1β）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、干擾素-γ（IFN-γ）。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Popgene1.32軟件對IL-8基因5'調控區(qū)SNPs數(shù)據(jù)進行群體遺傳多樣性分析，包括雜合度（H）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC），統(tǒng)計整理各突變位點的基因型頻率、等位基因頻率，用χ²檢驗方法對群體Hardy-Weinberg進行平衡檢測。運用SPSS25.0對各抗性指標數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析。

2 結果與分析

2.1 IL-8基因PCR測序結果

以提取的92只京海黃雞基因組DNA為模板，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中雞（Gallus gallus）IL-8基因上游-2000bp至-1bp的核苷酸序列設計的引物進行PCR擴增測序及拼接。測序共發(fā)現(xiàn)了3個SNPs突變位點（見表2），1號突變位點在一550堿基發(fā)生T→C的突變，命名為T-550C。2號突變位點在-398堿基發(fā)生G→T的突變，命名為G-398T。3號突變位點在-360堿基發(fā)生T→C的突變，命名為T-360C。詳細信息見圖1。

2.2 IL-8基因5'調控區(qū)SNPs突變引起的轉錄因子改變預測結果

由表3可見，IL-8基因5'調控區(qū)在-550bp發(fā)生了T→C的突變，此處突變導致原有的Oct-1轉錄因子結合位點消失;在-398bp發(fā)生了G→T的突變，導致此處原先C/EBPalp轉錄因子的結合位點發(fā)生位置改變，且新增了1個Pit-1a轉錄因子的結合位點;在-360bp的突變（T→C）導致原有的NF-1轉錄因子結合位點消失。

2.3 IL-8基因5'調控區(qū)多態(tài)性分析

對IL-8基因5'調控區(qū)發(fā)現(xiàn)的3個SNPs位點進行多態(tài)性及遺傳多樣性分析（表4），結果表明：3個突變位點均形成了3種基因型，雜合度均在0.436～0.471，PIC值在0.25～0.50，均屬于中度多態(tài)，遺傳差異性較大?？ǚ綑z驗結果顯示，3個突變位點均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。其中，除了G-398T突變位點外，原等位基因相對于突變后的等位基因均為優(yōu)勢等位基因，而G-398T突變位點突變后的等位基因為優(yōu)勢等位基因。

2.4 IL-8基因5'調控區(qū)多態(tài)性與血漿抗性指標的關聯(lián)分析

2.4.1 T-550C突變位點各基因型與雞球蟲杭性指標關聯(lián)分析T-550C突變位點各基因型與雞球蟲抗性指標關聯(lián)分析顯示（表5），除了SOD、MDA、NO和IL-1β指標外，TC型個體的其他指標均高于其他2種基因型，但差異不顯著（P>0.05）;TC型的IL-8表達量顯著高于TT型（P<0.05），其加性效應值和顯性效應值分別為9.10和19.15ng·L^-1;TT型個體的NO含量極顯著高于CC型（P<0.01），其加性效應值和顯性效應值分別為10.12和7.39μmol·L^-1。

2.4.2 G-398T突變位點各基因型與雞球蟲杭性指標關聯(lián)分析由表6可知，TT型個體SOD活性和GT型個體CAT活性均顯著高于GG型（P<0.05），SOD與CAT活性的加性效應值分別為46.77和0.035U·mL^-1，顯性效應值分別為10.99和0.175U·mL^-1;TT型個體NO含量均高于其他兩種基因型，且與GG型差異極顯著（P<0.01），與GT型差異顯著（P<0.05），其加性效應值和顯性效應值分別為10.86和2.365μmol·L^-1;TT型IL-2表達量顯著高于GT型（P<0.05），其加性效應值和顯性效應值分別為0.67和2.18ng·L^-1;TT型IL-1β、IL-8表達量均高于GG型個體，但未達到顯著水平（P>0.05）。

2.4.3 T-360C突變位點各基因型與雞球蟲抗性指標關聯(lián)分析 由T-360C突變位點各基因型與雞球蟲抗性指標關聯(lián)分析（表7）可知，除MDA、CAT、IL-1β、IFN-γ指標以外，TT型個體的其他指標均高于其他2種基因型;對于SOD活性，TT型個體與CC型差異極顯著（P<0.01），TC型個體與CC型個體差異顯著（P<0.05），其加性效應值和顯性效應值分別為64.43和10.55U·mL^-1;對于NO含量，TT型和TC型個體均顯著高于CC型個體（P<0.05），其加性效應值和顯性效應值分別為5.94和4.53μmol·L^-1;對于IL-2、IL-8表達量，TT型個體均顯著高于CC型個體（P<0.05），IL-2與IL-8活性的加性效應值分別為1.68和10.02ng·L^-1，顯性效應值分別為0.32和1.87ng·L^-1;對于IFN-γ含量，CC型個體顯著高于其他2種基因型個體（P<0.05），其加性效應值和顯性效應值分別為15.015和9.55ng·L^-1;TT型GSH-PX、IL-6指標均高于其他2種基因型，但差異不顯著（P>0.05）。

3 討論與結論

3.1 IL-8基因5'調控區(qū)的多態(tài)性檢測

5'調控區(qū)是基因轉錄調控的核心區(qū)域，該區(qū)域突變形成的SNPs可改變原有的轉錄因子結合位點和轉錄因子，從而影響與該基因有關性狀的表達。因此研究基因5'調控區(qū)SNPs及其與相關性狀的關聯(lián)分析是發(fā)掘新的分子遺傳標記的重要途徑之一[4，15]。寧娟[16]研究表明結構蛋白N和非結構蛋白Nsp2Marc-145細胞中表達能激活轉錄因子NF-κB，而活化的NF-κB進入核內與IL-8啟動子上的NF-κB位點結合后，能誘導IL-8的表達。Wu等[17]體外試驗結果表明，轉錄激活因子3（ATF3）的抑制可顯著提高人支氣管上皮細胞中促炎細胞因子IL-6和IL-8的表達。本研究在5'調控區(qū)共檢測到3個SNP位點：T-550C、G-398T和T-360C。這3個突變位點均形成了3種基因型，雜合度均在0.436～0.471，PIC值在0.25～0.50，均屬于中度多態(tài)，遺傳差異性較大，有利于雞育種中的群體遺傳分化。其中，T-550C和T-360C突變位點均是雜合型所占比例較高，TC為優(yōu)勢基因型，T為優(yōu)勢基因，而G-398T位點突變后的等位基因為優(yōu)勢等位基因，雜合型為優(yōu)勢基因型?？ǚ綑z驗結果顯示，3個突變位點均處于哈代一溫伯格平衡狀態(tài)，這可能是由于群體規(guī)模較大，突變位點沒有受到選種選配的影響或是在選育過程中達到了新的平衡。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：在-550bp發(fā)生了T→C的突變，導致原有的Oct-1轉錄因子結合位點消失;在-398bp發(fā)生了G→T的突變，導致此處原先C/EBPalp轉錄因子結合位點發(fā)生位置改變，且新增了1個Pit-1a轉錄因子的結合位點;在-360bp的突變（T→C）導致原有的NF-1轉錄因子結合位點消失。本研究發(fā)現(xiàn)的這3個突變位點均改變了其原有的轉錄因子結合位點，轉錄因子結合位點的改變可能使IL-8基因表達發(fā)生變化，進而影響血漿中IL-8的濃度。IL-8參與免疫反應，在炎癥和免疫應答中起著重要作用。有研究表明雞感染球蟲后，體內IL-8表達量越高，其抗球蟲能力越強[10]。因此推測轉錄因子結合位點的改變可能會影響雞抗球蟲能力，但具體機制有待進一步研究。

3.2 IL-8基因5'調控區(qū)的多態(tài)性與雞球蟲抗性指標的關系

目前有關雞IL-8基因的SNPs與球蟲抗性指標關聯(lián)分析的研究較少。本研究將5'調控區(qū)發(fā)現(xiàn)的3個SNPs與雞球蟲抗性指標關聯(lián)分析，結果表明：在T-550C位點突變后形成的3種基因型中，大多數(shù)指標均是TC型高于其他2種基因型，且TC型個體IL-8表達量顯著高于TT型。對于G-398T突變位點，TT型個體顯著或極顯著高于GG型的SOD、NO指標，顯著高于GT型的IL-2表達量，并且TT型IL-1β、IL-8表達量也都高于GG型個體，因此突變后的TT型個體可能抵抗球蟲病能力較強。對于T-360C突變位點，除了對MDA、GSH-Px、CAT、IL-1p、IL-6指標無顯著影響外，TT型和TC型個體的SOD活性極顯著或顯著高于CC型，TT型和TC型個體的NO含量均顯著高于CC型個體，TT型個體的IL-2、IL-8表達量均顯著高于CC型。IL-8參與免疫應答，能誘導中性粒細胞釋放溶酶體酶和清除病原體，在炎癥和免疫應答中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用。本研究在IL-8基因5'調控區(qū)檢測到的3個SNPS均改變了其原有的轉錄因子結合位點，進而影響IL-8基因的表達，導致血漿中IL-8的表達量升高，有效地提高雞體內的免疫水平，增強抵抗E.tenella的能力。

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（責任編輯：張梅）

收稿日期：2019-06-21初稿;2019-10-26修改稿

作者簡介：王曉慧（1994-），女，碩士，研究方向：家禽生產及抗病育種（E-mail：1216688368@qq.com）

通信作者：戴國?。?963-），男，博士，教授，研究方向：家禽生產及抗病育種（E-mail：daigj@yzu.edu.cn）

基金項目：江蘇現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（JATSf20181303）;“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD131302）;江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程（PAPD）;國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-41-G23）