劉孟粟 鐘璐芳 柯崇榕 高敏 夏華平 任洋 黃建忠

摘 要：篩選生絲微菌表達(dá)調(diào)控研究中最適合的內(nèi)參基因，為后續(xù)大幅度提高吡咯喹啉醌（PQQ）產(chǎn)量打下基礎(chǔ)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Realtime quantitative PCR， RTqPCR）技術(shù)分析生絲微菌基因組中6個(gè)候選內(nèi)參基因的相對表達(dá)情況，通過Bestkeeper、geNorm和NormFinder軟件分析，評價(jià)各個(gè)生長時(shí)期候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，確定最合適的內(nèi)參基因。結(jié)果表明：通過對生絲微菌4個(gè)不同生長時(shí)期的6個(gè)候選內(nèi)參基因（16S rRNA、gapdh、recA、ldh、rpoB和S5）的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析和評估，6個(gè)候選內(nèi)參基因均表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性和特異性，依據(jù)3款軟件的綜合評價(jià)，確定gapdh、recA這兩個(gè)內(nèi)參基因在兩株菌株不同時(shí)期均能穩(wěn)定表達(dá)。從6個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選出兩個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因gapdh基因和recA基因，用于后續(xù)生絲微菌的基因表達(dá)調(diào)控研究。

關(guān)鍵詞：吡咯喹啉醌;生絲微菌;內(nèi)參基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號：Q93 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號：0253-2301（2019）11-002

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.11.002

Screening and Validation of Internal Reference Genes of Hyphomicrobium of Pyrroloquinoline Quinone

LIU Mengsu， ZHONG Lufang， KE Chongrong， GAO Min， XIA Huaping， REN Yang， HUANG Jianzhong*

Abstract：The screening of the most suitable internal reference genes for the study on the regulation of the expression of Hyphomicrobium has laid a foundation for greatly increasing the yield of Pyrroloquinoline Quinone （PQQ）. The Realtime quantitative PCR technology was used to analyze the relative expression of 6 candidate reference genes in the genome of Hyphomicrobium. And the softwares of Bestkeeper， geNorm and NormFinder were used to evaluate the expression stability of candidate reference genes in each growth period and determine the most appropriate reference genes. The results showed that through the analysis and evaluation on the transcription situation of the six candidate reference genes （16S rRNA、gapdh、recA、ldh、rpoB and S5） at four different growth periods of Hyphomicrobium， the six candidate reference genes all showed a greater stability and specificity. And according to the comprehensive assessment of the three softwares， it was determined that the two internal reference genes gapdh and recA could be expressed stably in the two strains at different periods. Therefore， the genes gapdh and recA with stable expression were selected from the six candidate reference genes for further study on gene expression regulation of Hyphomicrobium.

Key words： Pyrrologuinoline quinone; Hyphomicrobium; Internal reference gene; Realtime fluorescence quantitative PCR

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是NAD/NADP和FMN/FAD之后的第三類氧化還原輔因子，是一類重要的醒蛋白輔基[1]。其廣泛存在于植物、動(dòng)物和人體組織器官中，具有明顯的抗氧化特性，被廣泛地認(rèn)為是一種高附加價(jià)值的生物基化學(xué)品[2-3]。生絲微菌作為PQQ的主要生產(chǎn)菌株之一，有必要分析PQQ合成基因的功能，更好的理解PQQ生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制，深入探究其生物合成途徑中基因表達(dá)調(diào)控對PQQ產(chǎn)量的提高有重要的意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）已成為定量研究功能基因組學(xué)中基因表達(dá)的重要研究工具，可以用于分析細(xì)菌、真菌、真核生物等不同生物體中特定基因的轉(zhuǎn)錄水平[4]。RTqPCR具有著精確的定量和靈敏度、特異性和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，但要使用RTqPCR分析基因表達(dá)，最重要的是選擇合適的內(nèi)參基因[5-7]。目前，已有研究結(jié)果表明，RTqPCR結(jié)果受到許多因素的影響。例如，反轉(zhuǎn)錄效率、所提取RNA的質(zhì)量、內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和RTqPCR的擴(kuò)增效率都將影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-10]。因此，合適和穩(wěn)定的內(nèi)參基因的篩選是保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠的前提。近期研究表明，PQQ更可能是一種抗神經(jīng)變性、抗癌和藥理劑，并且可以作為信號分子起作用[11-12]。PQQ是哺乳動(dòng)物生長發(fā)育和繁殖的必需生長因子，但是其自身并不能合成，只能從外界攝取[13-14]。目前能夠生產(chǎn)PQQ的物種包括Klebsiella pneumonia、Acinetobacter calcoaceticus、Methylobacterium extorquens、Gluconobacter oxydans、Enterobacter intermedium、Pseudomonas fluorescens和Pantoea ananatis[15]，但是產(chǎn)量較低，生絲微菌是目前發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)PQQ產(chǎn)量較高的菌株[16]。此外， PQQ是通過一個(gè)特殊的Pqq操縱子基因合成的，研究表明，PQQ生物合成所必需的基因包括PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE[17]。PQQ的合成步驟基本解釋清楚，但是PQQ合成基因調(diào)控機(jī)制還不清楚，并且對于其內(nèi)參基因的篩選和穩(wěn)定性表達(dá)還鮮有報(bào)道。本研究以不同時(shí)期生長的生絲微菌作為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析6個(gè)候選內(nèi)參基因，通過Bestkeeper、NormFinder和geNorm綜合評估和分析，篩選出合適的內(nèi)參基因，為后期試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

劉孟粟等：產(chǎn)吡咯喹啉醌的生絲微菌內(nèi)參基因的篩選和驗(yàn)證2019年第11期

2019年第11期劉孟粟等：產(chǎn)吡咯喹啉醌的生絲微菌內(nèi)參基因的篩選和驗(yàn)證

1.1.1 試驗(yàn)菌株 生絲微菌FJNU6（Hyphomicrobium denitrificans FJNU6 ）不同發(fā)酵時(shí)間（20、60、100、140 h）的2OD（OD650）菌液（每組3個(gè)平行），用DEPC水清洗2遍，用液氮速凍后保存在-80℃冰箱，用于提取RNA。此菌株由福建師范大學(xué)發(fā)酵工程研究中心分離保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 （1）主要試劑：總RNA提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒ProtoScript Ⅱ First Strand cDNA Synthesis Kit[NEB（北京）有限公司]，Trizol、DNaseI酶[寶生物工程（大連）有限公司]，熒光定量試劑盒FastStart Esswntial DNA Green Master（上海羅氏制藥有限公司）。（2）主要儀器：恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）、5 L發(fā)酵罐系統(tǒng)（上海國強(qiáng)生化）、微量分光光度計(jì)（Denovix）、紫外可見分光光度計(jì)UV 1800（島津）、BeckMan冷凍離心機(jī)（BeckMan Coultek）、Mini T金屬?。ˋllsheng）、LghtCycler@96羅氏熒光定量PCR儀（Roche）、Analytikjena PCR儀（Analytikjena）等儀器設(shè)備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和cDNA的合成 按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和Denovix微量分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，用DNA酶消化RNA中殘留的基因組，驗(yàn)證無基因組污染后，取5 μg純化后的RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系（100 μL）：d（T）23 VN 10 μL;ProtoScript Ⅱ Enzyme Mix （10×）10 μL;ProtoScript Ⅱ Reaction Mix （2×）50 μL;模板RNA 5 μL;最后用Nucleasefree H2O補(bǔ)足體積到100 μL，42℃金屬浴孵育1 h，然后在80℃條件下加熱5 min使酶失活，反轉(zhuǎn)出的cDNA于-20℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)，剩余的RNA于-80℃保存。

1.2.2 內(nèi)參基因選擇與引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)，選取6個(gè)常用的內(nèi)參基因：16S rRNA、gapdh、recA、ldh、rpoB、S5作為候選基因[17-19]。結(jié)合生絲微菌FJNU6全基因組為模板，用AlleleID 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列、長度和用途見表1。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以每個(gè)內(nèi)參基因的cDNA溶液依次稀釋10倍、20倍、30倍、40倍后為模板，進(jìn)行RTqPCR試驗(yàn)。采用羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀與熒光染料，反應(yīng)體系（25 μL）：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5 μL、PCR Forward primer 1 μL、PCR Rorward primer 1 μL、RT反應(yīng)液1 μL、ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 600 s;變性95℃ 10 s;解鏈58℃ 10 s;延伸72℃ 10 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和分析 使用羅氏的LightCycler

○R 96SW1.1程序分析出引物的擴(kuò)增效率（表1）。利用Bestkeeper[20]、NormFinder[21]和geNorm[22]軟件對6個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評估。BestKeeper程序通過平均Ct值的方差系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）兩個(gè)因素確定參考基因的穩(wěn)定性等級。geNorm是通過統(tǒng)計(jì)候選基因的M值大小進(jìn)而分析候選基因表達(dá)穩(wěn)定性。NormFinder使用基于建模的方法計(jì)算組內(nèi)和組間差異，檢測到穩(wěn)定性最高的參考基因。根據(jù)公式（Q=2Ctmax-Ctsample，Q為相對表達(dá)量，Ctmax為各樣品中最大Ct值，Ctsample為各樣品Ct值）計(jì)算出相對表達(dá)量，最后根據(jù)權(quán)重重新排列。此外，Ct值的顯著性差異采用SPSS的ANOVA（單因素）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生絲微菌FJNU6生長曲線

在5 L罐中發(fā)酵培養(yǎng)FINU6，繪制的生長曲線如圖1所示（時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD650為縱坐標(biāo)）。該曲線描述了絲狀微生物在發(fā)酵過程中的生長和PQQ合成。從圖1可以看出，0～24 h為滯后期，細(xì)胞基本處于未生長狀態(tài)，PQQ沒有合成。24～56 h為生絲微菌的對數(shù)生長期，菌體開始快速繁殖，PQQ初步合成。56～112 h是菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體的生長已經(jīng)趨于平緩，此時(shí)PQQ大量合成。112 h后，細(xì)菌開始分解進(jìn)入衰變期。因此，以培養(yǎng)過程中的24 h（細(xì)胞生長階段，PQQ未合成）、48 h（對數(shù)生長期、PQQ合成初期）、80 h（細(xì)胞生長穩(wěn)定期）和120 h（細(xì)菌衰變期）為培養(yǎng)過程中提取RNA的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.2 生絲微菌不同發(fā)酵時(shí)間總RNA提取

用Denvoix微分光光度計(jì)測定提取RNA濃度，A260/A280為1.9～2.0，表明樣品純度高。用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA。圖2結(jié)果表明，所提取的總RNA完整性較好，且未發(fā)生降解，符合以下試驗(yàn)要求。

2.3 內(nèi)參基因引物特異性及熒光定量PCR分析

將各樣品的cDNA等體積混合，混合溶液作為模板，通過PCR和凝膠電泳驗(yàn)證內(nèi)參基因引物的特異性。如圖3所示，PCR帶是單一的，沒有特異性擴(kuò)增，沒有引物二聚體，片段大小與靶片段的大小一致。利用各樣品的cDNA作為模板，對6個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行RTqPCR，從圖4可以看出，6個(gè)候選內(nèi)參基因的溶解曲線是尖銳的單一信號峰。另外，6個(gè)內(nèi)參基因的特異性更好，反應(yīng)特異性高，同時(shí)，6個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2大于0.99，表明Ct值與不同濃度cDNA的線性關(guān)系良好。另外，同一基因中不同曲線代表不同濃度的cDNA的定量反應(yīng)后的溶解曲線（圖4中的左側(cè)），可見rpoB和16S的差異較小，使得這些基因?qū)舛鹊挠绊戄^小。gapdh、S5、recA和ldh基因的差異明顯，說明模板濃度的大小會(huì)影響gapdh、S5、recA和ldh的變化，并且在隨后的熒光定量試驗(yàn)中應(yīng)注意cDNA的濃度。因此，可以用于隨后的試驗(yàn)。

2.4 6個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 Bestkeeper分析 各候選內(nèi)參基因的Ct值如表2所示，16S基因的表達(dá)水平較高（Ct值低，在6～8），不適合用作內(nèi)參基因。由表2所得的Ct值，利用Bestkeeper軟件分析出Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差std（Standard Deviation）和相關(guān)性系數(shù)r（coeff.of corr）。r值與基因間的相關(guān)性有關(guān)（r值越大，相關(guān)性越高）;而std值與基因穩(wěn)定性相關(guān)（std越小，穩(wěn)定性越好）。由表3可知，r值：

gapdh>S5>16S>ropB>recA>ldh，std值：gapdh=recA<16S

2.4.2 geNorm分析 根據(jù)geNorm軟件分析，M值越小，說明候選內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)越穩(wěn)定。圖5所示，MS5>MrpoB>Mgapdh>Mldh>M16S=MrecA。其中16S和recA的M值最小，表明在不同時(shí)期這兩個(gè)基因表達(dá)最平穩(wěn)。

通過配對差異值（Vn/Vn+1）確定內(nèi)參基因數(shù)目，Vn/Vn+1的值越小，則差異越小，此時(shí)的n值即為所需內(nèi)參基因的最佳數(shù)目。由圖6可知，V2/3的值最小，表明最適內(nèi)參基因數(shù)目為2。

通過geNorm軟件的統(tǒng)計(jì)和分析，根據(jù)所得的M值和配對差異值V。16S和 recA可以用作生絲微菌內(nèi)參基因的最優(yōu)選擇。

2.4.3 NormFinder分析 NormFinder軟件是通過計(jì)算組內(nèi)和組間差異來分析基因的表達(dá)穩(wěn)定性。穩(wěn)定性值（Stability value）越小，表明基因表達(dá)越穩(wěn)定。NormFinder分析結(jié)果顯示：16S（0.014）、S5（0.021）、rpoB（0.029）、gapdh（0.030）、recA（0.034）、ldh（0.041），所有候選基因的隨機(jī)表達(dá)穩(wěn)定值（S）均低于參考閥值，都可以作為內(nèi)參基因使用。

綜合Bestkeeper、geNorm和NormFinder分析結(jié)果，最終選擇gapdh與recA作為生絲微菌的雙內(nèi)參基因。

2.4.4 不同樣品中兩內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

進(jìn)一步選用兩株生絲微菌FJNU6和FJNUY菌株分別以gapdh和recA作為內(nèi)參基因，在4個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行檢測和驗(yàn)證。如圖7所示，gapdh和recA擴(kuò)增的Ct值都在23～27，顯示出較高的表達(dá)水平。SPSS單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：gapdh基因的P值（Pvalue ）為0.79>0.05，recA基因的P值為0.28>0.05。說明這兩個(gè)內(nèi)參基因在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)和不同菌株之間的表達(dá)穩(wěn)定。因此，gapdh和recA可以作生絲微菌的雙內(nèi)參基因。

3 討論與結(jié)論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTqPCR）是對常規(guī) PCR技術(shù)的進(jìn)一步補(bǔ)充和發(fā)展，可以準(zhǔn)確地分析基因在不同時(shí)期的表達(dá)差異性，已經(jīng)成為分子生物學(xué)中研究基因表達(dá)的主要方法[23-24]。理想的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性可以根據(jù)試驗(yàn)條件而不同，不同的環(huán)境條件下，內(nèi)參基因的表達(dá)水平可能存在差異[25-26]。目前，關(guān)于內(nèi)參基因的篩選，許多都是通過分析和評估單個(gè)基因的穩(wěn)定性[27-29]，單個(gè)內(nèi)參基因的應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性差等風(fēng)險(xiǎn)。所以對于內(nèi)參基因的篩選，為了達(dá)到最好的效果，需要考慮候選基因的穩(wěn)定性和重復(fù)性，還要考慮內(nèi)參基因的個(gè)數(shù)[30]。

研究表明，pqq合成基因的表達(dá)差異與PQQ產(chǎn)量有著直接關(guān)系[31]，低pH和有限的氧氣環(huán)境也會(huì)影響pqq合成基因的表達(dá)[32]，因此對pqq合成基因的表達(dá)研究對提高PQQ產(chǎn)量是很有必要的。我們通過查閱文獻(xiàn)并結(jié)合FJNUR6全基因組分析，選取了16S、gapdh、recA、ldh、rpoB、S5這6個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因。16S在大部分細(xì)菌中其序列都是保守的，常被用作內(nèi)參基因，但是，16S在生絲微菌中的Ct值在6～8，表達(dá)量過高，不適合做生絲微菌的內(nèi)參基因。雖然NormFinder分析結(jié)果表明6個(gè)候選內(nèi)參基因都可以用作生絲微菌的內(nèi)參基因使用，但是結(jié)合Bestkeeper和geNorm軟件的評估，gapdh和recA在樣品中穩(wěn)定性好，適合用于多個(gè)內(nèi)參的選擇。Gapdh是作為糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，recA是參與DNA修復(fù)的recA蛋白的編碼基因，兩者與生物的生命活動(dòng)息息相關(guān)，且表達(dá)相對穩(wěn)定，常用作內(nèi)參基因[33]。

由三款軟件分析并確定最終的內(nèi)參基因?yàn)間apdh和recA，并進(jìn)一步在兩株生絲微菌中驗(yàn)證，這兩個(gè)內(nèi)參基因在不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)和不同發(fā)酵菌株中均穩(wěn)定表達(dá)，可作為生絲微菌的內(nèi)參基因。

利用Bestkeeper、geNorm和NormFinder 軟件的評估和分析，最終確定了gapdh和recA基因作為生絲微菌FJNU6實(shí)時(shí)熒光定量PCR的雙內(nèi)參基因，同時(shí)使用兩個(gè)內(nèi)參基因使試驗(yàn)結(jié)果更加精確，這一研究結(jié)果為后續(xù)生絲微菌PQQ合成基因調(diào)控試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）

收稿日期：2019-11-02

作者簡介：劉孟粟，男，1993年生，碩士研究生，主要從事微生物代謝工程調(diào)控研究。

共同第一作者：鐘璐芳，女，1992年生，碩士研究生，主要從事微生物生理生化研究。

通信作者：黃建忠，男，1966年生，教授，主要從事微生物功能基因和工業(yè)酶制劑的研發(fā)工作（Email：hjz@fjnu.edu.cn）。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （21807011）;福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （2018J01673）;福建省省屬高?？蒲袑ｍ?xiàng)（JK2017012）。