羅澤萍　潘立衛(wèi)　李麗

摘要：【目的】揭示赪桐提取物（Extracts from Clerodendrum japonicum，EFC）對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌機(jī)理，為臨床抗病原菌感染藥及植物殺菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。【方法】采用紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法測(cè)定金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌對(duì)EFC的敏感性，明確EFC的抗菌活性;通過(guò)試劑盒、流式細(xì)胞儀及掃描電鏡等測(cè)定EFC作用后金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、三羧酸（TCA）循環(huán)、可溶性蛋白、胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、細(xì)胞凋亡及形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，研究EFC的抗菌機(jī)理?！窘Y(jié)果】EFC對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌和枯草芽孢桿菌3種供試細(xì)菌均具有抗菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性最強(qiáng)，其抑菌圈（IZ）、最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）分別為19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL。經(jīng)EFC作用10 h后，金黃色葡萄球菌的乳酸脫氫酶（LDH）、鉀離子（K+）及堿性磷酸酶（AKP）外泄分別顯著增加72.0%、43.0%和78.0%（P<0.05，下同），琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）活性分別顯著下降80.0%和36.4%。金黃色葡萄球菌經(jīng)EFC作用24 h后，與對(duì)照組相比，5MIC（2.50 mg/mL）、10MIC（5.00 mg/mL）和20MIC（10.00 mg/mL）組的胞外蛋白含量分別上升28.6%、41.8%和61.5%，胞內(nèi)蛋白含量分別下降40.9%、61.3%和82.5%，胞內(nèi)ROS水平分別增加9.1%、33.5%和51.0%，細(xì)胞凋亡率分別增加24.0%、50.6%和72.8%。經(jīng)EFC作用24 h后，掃描電鏡下的菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則、萎縮、畸形?！窘Y(jié)論】EFC通過(guò)破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性，影響蛋白合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮抑菌作用。

關(guān)鍵詞： 赪桐;提取物;金黃色葡萄球菌;抑菌機(jī)理

中圖分類號(hào)： S853.75? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2778-09

Antimicrobial activity of extracts from Clerodendrum japonicum and its antibacterial mechanism on Staphylococcus aureus

LUO Ze-ping1， PAN Li-wei1， LI Li2*

（1College of Chemical and Biological Engineering， Hechi University， Hechi， Guangxi? 546300， China;

2College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning? 530200，? China）

Abstract：【Objective】To reveal the antibacterial mechanism of extracts from Clerodendrum japonicum （EFC） against Staphylococcus aureus， and to provide a theoretical foundation for the research and development of clinical anti-pathogenic bacteria infection drugs and plant fungicides. 【Method】The sensitivity of S. aureus， Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis to EFC was determined by disk diffusion method and microbroth dilution method， and the antibacterial activity of EFC was determined. The changes of cytomembrane， cytoderm， tricarboxylic acid （TCA） cycle， soluble protein， intracellular reactive oxygen species（ROS） level， apoptosis and morphological structure of S. aureus treated with EFC were determined by kit， flow cytometry and scanning electron microscope to study the antibacterial mechanism of EFC. 【Result】EFC had antibacterial activity against S. aureus， S. typhimurium and B. subtilis， among which the antibacterial activity against S. aureus was the strongest， and its bacteriostatic zone（IZ）， minimum inhibitory concentration（MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC） were 19.04 mm， 0.50 mg/mL and 1.00 mg/mL， respectively. After 10 h of treatment with EFC， the leakage of lactate dehydrogenase（LDH）， potassium ion（K+） and alkaline phosphatase（AKP） of S. aureus increased significantly by 72.0%， 43.0% and 78.0%， respectively（P<0.05， the same below）. The activities of succinate dehydrogenase（SDH） and malate dehydrogenase（MDH） decreased significantly by 80.0% and 36.4%， respectively. After S. aureus was treated with EFC for 24 h， compared with the control group， the extracellular protein content of 5 MIC， 10 MIC and 20 MIC groups increased by 28.6%， 41.8% and 61.5%， respectively， while the intracellular protein content decreased by 40.9%， 61.3% and 82.5%， respectively. The intracellular ROS level increased by 9.1%， 33.5% and 51.0%， and the apoptosis rate increased by 24.0%， 50.6% and 72.8%， respectively. After 24 h of treatment with EFC， the morphology and structure of the bacteria were irregular， atrophied and deformed under scanning electron microscope. 【Conclusion】By destroying the completeness and permeability of the cytoderm and cytomembrane of S. aureus， EFC affecting protein synthesis which leads to the slowdown of TCA circulation and hence plays a role in antibacterial action. Therefore， strengthening the research on the antibacterial components of EFC is an important way to develop new， efficient and low-toxic anti-pathogenic drugs and plant fungicides.

Key words： Clerodendrum japonicum; extracts; Staphylococcus aureus; antibacterial mechanisms

0 引言

【研究意義】使用抗生素是臨床治療傳染性疾病的主要手段，但隨著抗生素的大量及不合理應(yīng)用，耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)，超級(jí)耐藥菌也隨之產(chǎn)生（Deng et al.，2015），而如何應(yīng)對(duì)多重耐藥菌帶來(lái)的危害已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注的重要課題之一。中藥作為我國(guó)醫(yī)學(xué)的寶貴遺產(chǎn)，具有獨(dú)特的資源優(yōu)勢(shì)，且毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性（楊健等，2016;樸喜航和艾紅佳，2017），推測(cè)利用中藥及其有效成分控制細(xì)菌感染及降低細(xì)菌耐藥性具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，研究并開發(fā)中藥抗菌制劑對(duì)避免耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】赪桐（Clerodendrum japonicum）為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬（Clerodendrum）植物，該屬植物因具有豐富的化學(xué)成分及獨(dú)特的藥理活性而受到廣泛關(guān)注。田軍和孫漢董（1995）應(yīng)用正反相硅膠柱層析、中壓柱層析及制備性薄層層析等手段，從赪桐中分離得到4個(gè)苯丙素苷類成分，同時(shí)獲得22，23-二氫菠甾醇、豆甾醇、25，26-去氫豆甾醇、烏索酸、丁二酸酐和小麥黃素等化合物。尚冀寧（2010）對(duì)赪桐乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4個(gè)萃取部分的化學(xué)成分進(jìn)行分離，結(jié)果鑒定出17種化合物，分別屬于二萜、黃酮、甾體和香豆素等類型。陳俊等（2013）采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加及小鼠棉球肉芽腫等急慢性炎癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赪桐根水提物對(duì)急慢性炎癥有明顯的抗炎作用。焦楊等（2016）采用細(xì)胞溶血法研究赪桐醇提取物經(jīng)典途徑和旁路途徑的抗補(bǔ)體活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性。張樹琳（2018）利用系統(tǒng)溶劑法、正反相硅膠色譜和制備型HPLC等方法從赪桐乙醇提取物的乙酸乙酯中分離獲得35種化合物，其中化合物Japonicum cyclic pentapeptide A、Japonicum cyclic pentapeptide B、Hydroxyhomodestru-xin B及Hydroxydestruxin B具有抗腫瘤活性。目前，關(guān)于赪桐抗菌活性的研究甚少，但已有大量研究表明同屬植物臭牡丹、苦郎樹和大青葉等均具有抑菌活性。臭牡丹提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色葡萄球菌和大腸埃希菌等均有較強(qiáng)的抑制作用（劉建新等，2015）;苦郎樹葉提取化合物（KLS-46和KLS-54）對(duì)西瓜枯萎病菌、芒果葉枯病菌、甘蔗鳳梨病菌等植物病原真菌有明顯抑菌活性（鄧業(yè)成等，2012）;大青葉粗黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌具有明顯抑制作用（劉富康等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】赪桐在廣西的資源非常豐富，但在臨床上的應(yīng)用并不廣泛，通常作為可供觀賞的園藝栽培植物，其藥理作用及機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】測(cè)定赪桐提取物（Extracts from C. japonicum，EFC）對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、三羧酸（TCA）循環(huán)、可溶性蛋白、胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、細(xì)胞凋亡及形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，揭示其抗菌機(jī)理，為臨床抗病原菌感染藥及植物殺菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為赪桐的新鮮莖葉，母株采自廣西河池市宜州區(qū)小龍村。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、傷寒桿菌（ATCC13311）和枯草芽孢桿菌（ATCC9372）由河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室保藏提供?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒（批號(hào)S0033）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;鉀離子（K+）測(cè)定試劑盒（批號(hào)2018003）購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20171212）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（批號(hào)20171221）、琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒（批號(hào)20171225）、蘋果酸脫氫酶（MDH）試劑盒（批號(hào)20171225）購(gòu)自南京建成生物工程研究所;蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)20171116）購(gòu)自北京常萊寶科技有限公司;乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號(hào)20180319）購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：AUW220D電子天平（日本島津），HVE-50全自動(dòng)滅菌鍋（日本Hirayama），SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），F(xiàn)orma 3110生化培養(yǎng)箱（美國(guó)熱電公司），SU80-40掃描電鏡（日立），DH-20F臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙市百諾克離心機(jī)儀器有限公司），Agilent 8453紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫科技公司），Accuri? C6 Plus流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），CS-2000高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司），xMark酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司）。

1. 2 赪桐提取物制備

將新鮮采摘的赪桐莖葉置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎成粉末。稱取500 g赪桐粉末，80%乙醇（料液比1∶10）超聲波提取3次，每次1 h，合并濾液，濃縮回收乙醇，得浸膏131.8 g，浸膏以少量純化水分散懸浮，再用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取，減壓濃縮蒸干溶劑，得到正丁醇相浸膏54.0 g。

1. 3 抑菌圈（IZ）測(cè)定

IZ試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，并以無(wú)菌水及慶大霉素作為對(duì)照。

1. 4 最小抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法（鄭翠萍等，2015）測(cè)定EFC的MIC和MBC，設(shè)5次平行試驗(yàn)，以刃天青作為指示劑，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的孔呈藍(lán)色，有細(xì)菌生長(zhǎng)的孔則逐漸由藍(lán)色變成粉色，并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組（加菌和加慶大霉素）及陰性對(duì)照組（加菌和加無(wú)菌水）。

1. 5 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

菌體處理方法：在肉湯培養(yǎng)基中分別加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和EFC，使藥物終濃度為2.5 mg/mL，另設(shè)無(wú)菌水為空白對(duì)照，于37 ℃下130 r/min搖床培養(yǎng)。取各組培養(yǎng)液2.0 mL，4000 r/min離心10 min，棄沉淀，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定各時(shí)段培養(yǎng)液上清液中的LDH活性（黎芳靖，2018）;按照鉀離子測(cè)定試劑盒說(shuō)明測(cè)定各時(shí)段培養(yǎng)液上清液中的K+濃度（黃巍等，2017）。

1. 6 細(xì)胞壁通透性測(cè)定

菌體處理方法同1.5。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定各時(shí)段培養(yǎng)液上清液中的AKP活性（劉昊等，2017）。

1. 7 可溶性蛋白含量測(cè)定

在肉湯培養(yǎng)基中分別加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和EFC，使藥物終濃度為0、2.50、5.00和10.00 mg/mL。于37 ℃下130 r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)24 h，取各組培養(yǎng)液4000 r/min離心10 min，分別收集上清液和沉淀，測(cè)定上清液蛋白含量即胞外可溶性蛋白含量，沉淀用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌3次，再加入蒸餾水5.0 mL，超聲波處理20 min后4000 r/min離心10 min，去除沉淀，然后測(cè)定上清液蛋白含量即胞內(nèi)可溶性蛋白含量（李璐等，2016）。蛋白含量參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1. 8 TCA循環(huán)影響測(cè)定

菌體處理方法同1.5。參照Li等（2017）的方法收集菌體，然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定各時(shí)段培養(yǎng)液上清液中的SDH和MDH活性。

1. 9 胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

菌體處理方法同1.7。取連續(xù)培養(yǎng)12 h的各組培養(yǎng)液，參照黃燕飛（2016）的方法收集菌體;再根據(jù)試劑盒說(shuō)明采用流式細(xì)胞儀（FCM）測(cè)定各樣品熒光強(qiáng)度。

1. 10 細(xì)胞凋亡測(cè)定

菌體處理方法同1.7。取連續(xù)培養(yǎng)20 h的各組培養(yǎng)液，參照黃燕飛（2016）的方法收集菌體;再根據(jù)試劑盒說(shuō)明采用FCM測(cè)定各樣品熒光強(qiáng)度。

1. 11 超微結(jié)構(gòu)分析

菌體處理方法同1.5。取連續(xù)培養(yǎng)24 h的各組培養(yǎng)液，參照黃燕飛（2016）的方法收集菌體;再參照王永剛等（2018）的方法制備電鏡樣品后進(jìn)行掃描電鏡（SEM）觀察。

1. 12 生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法

菌體處理方法同1.7。紫外分光光度計(jì)（600 nm）測(cè)定各組培養(yǎng)液中不同時(shí)間點(diǎn)的吸光值。

1. 13 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中組間兩兩比較采用 t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 EFC的IZ、MIC及MBC測(cè)定結(jié)果

由表1可知，EFC對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有不同程度的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌（G+）、傷寒沙門菌（G?）和枯草芽孢桿菌（G+）的IZ分別為19.04、14.85和10.04 mm，MIC分別為0.50、1.25和2.50 mg/mL，MBC分別為1.00、2.50和5.00 mg/mL。EFC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，因此有必要對(duì)其抑菌機(jī)制進(jìn)行深入研究。

2. 2 細(xì)胞膜完整性測(cè)定結(jié)果

細(xì)胞膜是金黃色葡萄球菌的保護(hù)屏障之一。LDH是一種胞內(nèi)酶，正常情況下不會(huì)外漏，當(dāng)菌體細(xì)胞膜受損時(shí)LDH可從胞漿滲出至培養(yǎng)液中，即通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活性的變化可推斷細(xì)胞膜是否完整。細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)離子也可穿過(guò)細(xì)胞膜而外泄，導(dǎo)致培養(yǎng)液中離子濃度增加。由圖1和圖2可知，與對(duì)照組相比，LDH和K+外泄均呈逐漸增加趨勢(shì)，培養(yǎng)至10 h時(shí)LDH、K+外泄分別增加72.0%和43.0%，差異顯著（P<0.05，下同）。說(shuō)明EFC可能具有破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物大量外泄。

2. 3 細(xì)胞壁完整性測(cè)定結(jié)果

培養(yǎng)基上清液AKP活性改變可反映菌體細(xì)胞壁通透性的變化，藥物處理后菌液AKP活性增加，說(shuō)明藥物可破壞菌體細(xì)胞壁，而失去對(duì)菌體的保護(hù)作用，最終致使細(xì)菌溶解死亡。由圖3可看出，EFC組培養(yǎng)液中的AKP活性較對(duì)照組高，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。培養(yǎng)至10 h時(shí)AKP活性較對(duì)照組增加78.0%，且差異顯著。說(shuō)明EFC可能具有破壞金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁完整性的作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌胞AKP大量外泄。

2. 4 可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，金黃色葡萄球菌經(jīng)EFC作用24 h后，其胞外蛋白含量與對(duì)照組相比呈明顯的上升趨勢(shì)，5MIC（2.50 mg/mL）、10MIC（5.00 mg/mL）和20MIC（10.00 mg/mL）組分別上升28.6%、41.8%和61.5%，可能是細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致部分蛋白外漏所致。與對(duì)照組相比，胞內(nèi)蛋白含量呈明顯下降趨勢(shì)，5MIC、10MIC和20MIC組分別下降40.9%、61.3%和82.5%，可能是EFC對(duì)金黃色葡萄球菌蛋白具有一定的抑制作用，通過(guò)破壞部分蛋白結(jié)構(gòu)而抑制蛋白合成。

2. 5 TCA循環(huán)影響測(cè)定結(jié)果

SDH和MDH是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵調(diào)控酶，檢測(cè)培養(yǎng)液中SDH和MDH的活性能間接反映菌體內(nèi)能量代謝的情況。由圖5和圖6可知，EFC組的SDH和MDH活性與對(duì)照組相比明顯下降，連續(xù)培養(yǎng)10 h后SDH和MDH活性分別顯著下降80.0%和36.4%。說(shuō)明EFC能抑制金黃色葡萄球菌的SDH和MDH活性，進(jìn)而擾亂菌體內(nèi)能量代謝。

2. 6 胞內(nèi)ROS水平測(cè)定結(jié)果

ROS作為細(xì)菌新陳代謝的產(chǎn)物在細(xì)胞中不斷產(chǎn)生和消除，ROS系統(tǒng)失衡會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ROS水平變化在一定程度上可反映細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部活性的變化。2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）本身沒(méi)有熒光，可自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入胞內(nèi)后可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。DCFH不會(huì)通透細(xì)胞膜，因此探針極易被積聚在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧能將無(wú)熒光的DCFH氧化生成具有熒光的DCF。本研究通過(guò)DCFH-DA單染色法，采用FCM檢測(cè)DCF熒光強(qiáng)度以評(píng)價(jià)細(xì)菌胞內(nèi)ROS水平。由圖7可知，5MIC、10MIC和20MIC組金黃色葡萄球菌的ROS含量與對(duì)照組相比分別增加9.1%、33.5%和51.0%，說(shuō)明EFC可能通過(guò)擾亂細(xì)菌ROS平衡而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的作用。

2. 7 細(xì)胞凋亡測(cè)定結(jié)果

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在環(huán)境條件改變時(shí)為了維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而通過(guò)基因調(diào)控使其自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程。本研究采用Annexin-V/PI復(fù)染法檢測(cè)菌體細(xì)胞凋亡，結(jié)果（圖8）顯示，金黃色葡萄球菌經(jīng)EFC處理后，Annexin V-FITC染色呈陽(yáng)性且PI染色呈陰性的細(xì)胞即凋亡細(xì)胞（圖右下象限Q4-LR）呈增加趨勢(shì);Annexin V-FITC染色和PI染色均呈陽(yáng)性的細(xì)胞即壞死細(xì)胞（圖右上象限Q4-UR）也有所增加;Annexin V-FITC染色呈陰性而PI染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞（圖左上象限Q4-UL）則是許可范圍內(nèi)檢測(cè)誤差所在象限。細(xì)胞凋亡率=Q4-UR+Q4-LR。由圖8可知，5MIC、10MIC和20MIC組的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比分別增加24.0%、50.6%和72.8%，說(shuō)明EFC的抑菌作用可能與其促使金黃色葡萄球菌發(fā)生細(xì)胞凋亡及影響菌體系列基因激活、表達(dá)和調(diào)控有關(guān)。

2. 8 菌體超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

對(duì)照組金黃色葡萄球菌在掃描電鏡下外觀飽滿、形態(tài)規(guī)則、表面光滑（圖9-A）;而經(jīng)EFC作用24 h后，掃描電鏡下的菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則、萎縮、畸形（圖9-B）。說(shuō)明EFC具有破壞菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用，可能與破壞菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及抑制蛋白合成等有關(guān)。

2. 9 生長(zhǎng)曲線圖繪制結(jié)果

生長(zhǎng)曲線可表征菌體的生長(zhǎng)規(guī)律，同時(shí)反映藥物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)增殖周期的抑制情況。由圖10可知，對(duì)照組金黃色葡萄球菌培養(yǎng)2 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)22～24 h后進(jìn)入細(xì)菌穩(wěn)定生長(zhǎng)期，培養(yǎng)26 h后進(jìn)入衰亡期。加入EFC后，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)受到抑制，其生長(zhǎng)曲線發(fā)生明顯改變，未出現(xiàn)快速生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，說(shuō)明EFC具有抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)繁殖的作用，其抑菌機(jī)理可能與縮短細(xì)菌分裂速度有關(guān)。

3 討論

細(xì)菌細(xì)胞膜通過(guò)調(diào)節(jié)和選擇必需養(yǎng)分及代謝產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞，從而維持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定和有序運(yùn)行。K+能維持細(xì)胞內(nèi)外液的滲透壓平衡，當(dāng)細(xì)胞膜通透性增大時(shí)，K+大量外泄（Cox et al.，2000）。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)EFC作用后金黃色葡萄球菌的胞內(nèi)蛋白、LDH和K+均出現(xiàn)外泄，說(shuō)明EFC具有破壞菌體細(xì)胞膜或促使細(xì)胞膜通透性增大的作用。AKP存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間，主要參與細(xì)菌磷代謝，當(dāng)細(xì)胞壁通透性增大或受損時(shí)會(huì)發(fā)生大量AKP外泄（劉昊等，2017）。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)EFC處理后的金黃色葡萄球菌AKP大量外泄，說(shuō)明EFC具有破壞細(xì)胞壁完整性或增大細(xì)胞壁通透性的作用。蛋白作為生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)廣泛存在于菌體內(nèi)，在藥物作用下菌體蛋白結(jié)構(gòu)受損或合成受抑制，導(dǎo)致部分生物功能消失。經(jīng)EFC處理的金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白含量明顯下降，說(shuō)明EFC的抑菌機(jī)理可能與阻礙菌體某些蛋白合成有關(guān)。

TCA循環(huán)是機(jī)體糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式，也是糖、脂類、蛋白及核酸代謝與轉(zhuǎn)化的樞紐。SDH和MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶（Naseri et al.，2016）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)EFC處理后金黃色葡萄球菌的MDH和SDH活性較對(duì)照組明顯降低，說(shuō)明EFC的抑菌作用與破壞或抑制TCA循環(huán)有關(guān)。ROS可使類脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成機(jī)體多種損傷和病變，而加速衰老（Elloumi et al.，2017;Vassie et al.，2017）。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)EFC處理后金黃色葡萄球菌胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組相比明顯增加，說(shuō)明EFC破壞了菌體ROS與抗氧化系統(tǒng)間的平衡。此外，經(jīng)EFC處理后金黃色葡萄球菌的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯上升，說(shuō)明EFC具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

李開泉等（2002）研究發(fā)現(xiàn)烏索酸能抑制金色葡萄糖球菌及酵母的生長(zhǎng);趙雁武等（2003）研究證實(shí)3，4-二羥基苯甲醛對(duì)金黃葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用;孫濤（2013）研究發(fā)現(xiàn)七星瓢蟲的次生代謝產(chǎn)物對(duì)羥基苯乙醇對(duì)沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抑菌活性;蔡百祥等（2015）研究表明0.6 mg/mL丁香脂素對(duì)油菜菌核病菌的抑制率達(dá)36.72%;石麗娟（2015）研究證實(shí)反式對(duì)羥基肉桂酸對(duì)小麥赤霉病菌的半數(shù)有效濃度（EC50）為10.80 mg/L;熊麗霞（2016）研究發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲醛對(duì)釀酒酵母表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，且枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對(duì)對(duì)羥基苯甲醛也較敏感;陸?。?018）研究證實(shí)芹菜素是鴨兒芹發(fā)揮抗氧化和抗菌活性的主要活性成分;楊光等（2018）研究表明對(duì)羥基苯甲酸對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用。根據(jù)以上文獻(xiàn)推測(cè)，張樹琳（2018）從赪桐提取分離的化合物馬桶花酮、3，4-二羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛、丁香脂素和反式對(duì)羥基肉桂酸等可能都是赪桐的有效抑菌活性成分。此外，從赪桐中提取獲得的烏索酸（田軍和孫漢董，1995）和芹菜素（尚冀寧，2010）可能也是抑菌活性成分。赪桐化學(xué)成分種類較多，且其單一成分藥理活性作用廣泛。本研究結(jié)果表明，EFC具有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)金色葡萄糖球菌的IZ、MIC、MBC分別為19.04 mm、0.50 mg/mL和1.00 mg/mL，可能是通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性，影響蛋白合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮作用，但具體抑菌作用機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

EFC通過(guò)破壞黃金色葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性及通透性，影響蛋白合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)減慢而發(fā)揮抑菌作用。因此，加強(qiáng)EFC抑菌活性成分研究是開發(fā)新型、高效、低毒抗病原菌感染藥和植物殺菌劑的重要基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）