唐萍　代飛燕　吳毅歆　葉敏　何月秋

摘要：【目的】研究貝萊斯芽孢桿菌DJB5的生物安全性，為DJB5的開(kāi)發(fā)和安全使用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā繀⒖嘉⑸锞鷦┌踩缘南嚓P(guān)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)灌胃DJB5菌體和發(fā)酵液的方式測(cè)定DJB5對(duì)昆明小鼠的急性經(jīng)口毒性;通過(guò)腹腔注射菌體的方法研究DJB5的致病性;測(cè)試DJB5對(duì)昆明小鼠的急性眼刺激性、皮膚刺激性和溶血性;用紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)DJB5的抗菌藥物敏感性?！窘Y(jié)果】DJB5菌體對(duì)昆明小鼠的急性經(jīng)口半致死劑量（LD50）>5000 mg/kg，灌胃菌體（5000 mg/kg BW）及5和10倍發(fā)酵上清濃縮液14 d后，昆明小鼠的體征、各臟器石蠟切片、血相和生化指標(biāo)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）;腹腔注射DJB5菌體（500 mg/kg BW）后，處理組昆明小鼠的臟器系數(shù)和體重與對(duì)照組無(wú)顯著差異;DJB5對(duì)昆明小鼠眼和皮膚無(wú)刺激性、無(wú)溶血性，且對(duì)受試的青霉素G、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素等9種抗菌藥物敏感?！窘Y(jié)論】貝萊斯芽孢桿菌DJB5及其發(fā)酵液的生物安全性高，具有開(kāi)發(fā)成防治玉米貯藏期黃曲霉制劑的潛力。

關(guān)鍵詞： 貝萊斯芽孢桿菌DJB5;生物安全性;抗生素;黃曲霉

中圖分類(lèi)號(hào)： S182? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2720-08

Biosafety evaluation of Bacillus velezensis DJB5

TANG Ping1， DAI Fei-yan2， WU Yi-xin3，4， YE Min1*， HE Yue-qiu3，4*

（1College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2College of Animal Medicine， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China; 3College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University，Kunming? 650201， China; 4National and Local Joint Engineering Center for

Screening and Application of Microbial Strains， Kunming? 650217， China）

Abstract：【Objective】The biosafety of Bacillus velezensis DJB5 was studied to lay a foundation for the development and safe application of DJB5. 【Method】Based on standards of microbial agent safety， the acute oral toxicity was studied with stomach perfusion of DJB5 bacterial cells and fermentation supernatant， and pathogenicity was determined by the ways of intraperitoneal injections. Acute eyes， skin irritations and hemolytic tests were proceeded in Kunming mice. Antibiotic resistance was also tested by agar diffusion method. 【Result】The results displayed that its acute oral toxicity median lethal dose（LD50） was >5000 DJB5 cells/kg， stomach filling with maximum 5000 mg/kg BW DJB5 and 5 and 10 times of concentrated formulated suspension for 14 d did not cause significant differences of body sign， organs section， hemogram biochemical indicators with negative control（P>0.05， the same below）. Intraperitoneal injection with 5000 mg/kg BW DJB5 did not cause any difference of Kunming mouse’s organ coefficient and weight with negative control. Strain DJB5 did not irritate Kunming mouse’s eyes and skin. It did not show hemolysis， but was sensitive to nine antibiotics including penicillin G， cefazolin， amikacin， gentamicin， erythrocin， norfloxacin， ciprofloxacin， selectrin， and chloramphenicol. 【Conclusion】Results indicates that strain DJB5 and its formulated suspension are biologically safe and has the potential to develop a biocontrol agent to control Aspergillus flavus.

Key words： Bacillus velezensis DJB5; biosafety; antibiotics; Aspergillus flavus

0 引言

【研究意義】一直以來(lái)，人類(lèi)用化學(xué)農(nóng)藥防治作物病蟲(chóng)害，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的負(fù)面影響使人們把目光逐漸轉(zhuǎn)向環(huán)境相容性好和生物選擇性高的生物防治，生防物質(zhì)的開(kāi)發(fā)成為作物病蟲(chóng)害防治研究熱點(diǎn)。隨著科技的發(fā)展，人們對(duì)生物防治的理論認(rèn)識(shí)逐漸深入，越來(lái)越多的生防物質(zhì)被篩選出來(lái)并投入到環(huán)境中，在植物病蟲(chóng)害防治及作物促生長(zhǎng)方面發(fā)揮了積極作用，減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用。然而，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)并非所有的生防物質(zhì)都安全，人們開(kāi)始質(zhì)疑傳統(tǒng)生物防治“無(wú)污染、無(wú)破壞、安全無(wú)毒”的概念。目前對(duì)于生防物質(zhì)的研究主要集中在其產(chǎn)生的效應(yīng)及作用機(jī)理方面，而忽略其生物安全性，如果投入到環(huán)境中的功能微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)不安全，該生防物質(zhì)通過(guò)食物鏈和作物殘留將成為新的污染物甚至是有毒物質(zhì)，那么生防物質(zhì)的篩選和研究將失去意義（Borriello et al.，2003;Skrobek and Butt，2005）。因此，在生防菌開(kāi)發(fā)應(yīng)用前對(duì)其進(jìn)行安全性研究顯得格外重要。【前人研究進(jìn)展】來(lái)源于土壤的洋蔥伯克氏細(xì)菌（Burkholderia cepacia，簡(jiǎn)稱(chēng)Bc）能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，且能防治由卵菌及其他真菌引起的土傳病害（Parke? and Gurian-Sherman，2001），其作為有效的生防制劑已在國(guó)內(nèi)外注冊(cè)并使用，但研究發(fā)現(xiàn)很難區(qū)分洋蔥伯克氏生防菌和人體致病菌，意味著分離于自然環(huán)境中的Bc生防菌存在對(duì)人體致病的潛在風(fēng)險(xiǎn)（羅遠(yuǎn)嬋和謝關(guān)林，2005）。近年來(lái)，為降低Bc菌帶來(lái)的致病威脅，美國(guó)環(huán)保署限制了Bc生防菌的使用方式和用量，并對(duì)其進(jìn)行撤銷(xiāo)登記和禁用管理（Jennifer，2000）。樊龍江等（2003）發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt（蘇云金芽孢桿菌，Bacillus thuringiensis）殺蟲(chóng)蛋白基因的水稻花粉漂落在桑葉上的數(shù)量為92.9粒/cm2時(shí)，會(huì)明顯影響家蠶的生長(zhǎng)發(fā)育，該研究認(rèn)為南方養(yǎng)蠶地區(qū)推廣轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)蠶有負(fù)面影響。有研究表明，活體微生物作為益生菌，其耐藥基因在腸道中轉(zhuǎn)移給病原菌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增大（Salyers et al.，2004;Mathur and singh，2005），明串珠菌（Leuconostobiaceae）和片球菌（Pediococcus）可獲得來(lái)自乳酸菌（Lactococcus）的耐藥性質(zhì)粒（Sablon et al.，2000）。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）是常用的生物防治菌種，但研究發(fā)現(xiàn)部分菌株能產(chǎn)生對(duì)紅細(xì)胞有溶血作用的溶血素（Sansinenea and Ortiz，2011;Nasir and Besson，2012），其溶血性限制了功能菌株的應(yīng)用（Liu et al.，2010;Teixeira et al.，2013;Algburi et al.，2016）。馬鳴超等（2016）收集了23株微生物肥料功能曲霉菌，并對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)黃曲霉毒素檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）CGMCC3.4407能產(chǎn)生至少1×103 μg/kg以上的黃曲霉毒素B1。由此可見(jiàn)，為保障人類(lèi)健康和環(huán)境安全，必須對(duì)生物技術(shù)及其產(chǎn)品進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，采取嚴(yán)格的管理和控制措施，以降低其對(duì)人類(lèi)和環(huán)境影響的風(fēng)險(xiǎn)（Qian et al.，2007）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】芽孢桿菌具有許多有價(jià)值的性狀和較好的生防功能（Ongena and Jacques，2008;Foster and Woodruff，2010），在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)里，從芽孢桿菌中分離到上百個(gè)具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物使得芽孢桿菌在眾多領(lǐng)域具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力（Stein，2010;鄒遠(yuǎn)軍等，2017）。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物防治實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室）從疊鞘石斛（Dendrobium aurantiacum）植株中分離到具有廣譜抑菌作用的貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）DJB5（以下簡(jiǎn)稱(chēng)DJB5），其對(duì)黃曲霉具有較好的抑制生長(zhǎng)和降解毒素作用（袁遠(yuǎn)等，2019）。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)種，其與很多芽孢桿菌一樣能產(chǎn)生多種抗菌次生代謝產(chǎn)物，已有多株貝萊斯芽孢桿菌被篩選出來(lái)，在植物病害生物防治中具有極大的潛力（Palazzinia et al.，2016;孫平平等，2018），但目前關(guān)于DJB5生物安全性的研究尚無(wú)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為明確DJB5的生物安全性，參考微生物菌劑安全性的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，從急性毒性、致病性、眼部刺激性、皮膚刺激性、溶血性和抗菌藥物敏感性等方面研究DJB5的生物安全性，為DJB5安全應(yīng)用于玉米儲(chǔ)藏期黃曲霉污染防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 DJB5由本課題組從云南省普洱市疊鞘石斛中分離獲得。

1. 1. 2 供試動(dòng)物 體重18～22 g的SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，供試小鼠及飼料均購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)中心（許可證號(hào)SCXK滇K2015-0002）。昆明小鼠健康，符合試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量要求，在小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后投入試驗(yàn)，動(dòng)物房室溫控制在（22±3）℃，相對(duì)濕度35%～65%，換氣次數(shù)10～20次/h，正常晝夜交替照明。

1. 1. 3 試驗(yàn)儀器 HC-3018R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、DIRUI CS-400B生化儀、mindray BC-2800vet血液細(xì)胞分析儀、FD5-series冷凍干燥機(jī)、Pannoramic 250/MIDI掃描儀、JJ-12J脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)、Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng)、1/10000 CP214 OHAUS分析天平、SYQ-DSX-280B高壓滅菌器和SHZ-82氣浴恒溫振蕩器。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 供試菌粉制備 冷凍保存的DJB5甘油菌株在LB培養(yǎng)基上劃線(xiàn)活化培養(yǎng)，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下180 r/min搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液離心后棄上清液，沉淀菌體用滅菌水清洗離心，再經(jīng)冷凍干燥制得DJB5菌粉，活菌含量為2.5×1014 CFU/g。

1. 2. 2 供試發(fā)酵液制備 DJB5在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下180 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液離心后收集上清液，并通過(guò)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾除去菌體，再經(jīng)冷凍干燥制得DJB5發(fā)酵上清液干燥物，干燥物用0.9%生理鹽水稀釋成5和10倍濃縮液。

1. 2. 3 急性經(jīng)口毒性檢測(cè)

1. 2. 3. 1 DJB5菌體經(jīng)口毒性試驗(yàn) 參照NY/T 1109—2017《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》中的最大限量法，選擇體重20 g左右的健康昆明小鼠20只，雌雄各半。昆明小鼠禁食6 h后，以5000 mg/kg BW劑量一次性灌胃DJB5，菌體用0.9%生理鹽水配制，灌胃體積為40 mL/kg BW，灌胃后禁食2 h，之后正常飼養(yǎng)并連續(xù)觀(guān)察14 d，記錄昆明小鼠的中毒癥狀和死亡情況。檢查昆明小鼠器官的形態(tài)、顏色等，制作心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺臟石蠟切片觀(guān)察病變情況。

1. 2. 3. 2 DJB5發(fā)酵上清液經(jīng)口毒性試驗(yàn) 昆明小鼠隨機(jī)分成3組，分別為對(duì)照組、發(fā)酵上清液5倍液組和10倍液組，每組20只，雌雄各半。昆明小鼠處理前禁食6 h，每只昆明小鼠一次性灌胃0.8 mL發(fā)酵液，灌胃后禁食2 h，之后正常飼養(yǎng)。灌胃處理后3和14 d，取各處理組昆明小鼠10只，雌雄各半，采用眼球摘除法取血，測(cè)定血液相關(guān)生理生化指標(biāo)和血相指標(biāo)。同時(shí)立即解剖昆明小鼠，觀(guān)察其內(nèi)臟器官，并制作心臟、肝臟、腎臟、脾臟和肺臟石蠟切片觀(guān)察病變情況。

1. 2. 4 生理生化指標(biāo)檢測(cè)方法 對(duì)昆明小鼠進(jìn)行眼球摘除法采血，血液靜置凝結(jié)后以3000 r/min離心2 min，取血清測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）等生理生化指標(biāo)。

1. 2. 5 血相指標(biāo)檢測(cè)方法 對(duì)昆明小鼠進(jìn)行眼球摘除法采血，取0.3 mL血樣，收集于EDTA抗凝管中，用血細(xì)胞分析儀測(cè)定白細(xì)胞數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）和血紅蛋白（HGB）等血項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)。

1. 2. 6 昆明小鼠器官病變觀(guān)察 取昆明小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等器官，用4%甲醛溶液浸泡固定24 h，經(jīng)石蠟包埋并制作切片，采用蘇木精—伊紅（H-E）染色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察病理改變并拍照。

1. 2. 7 致病性試驗(yàn) 采用腹腔注射的方法，選擇體重18～20 g的健康成年昆明小鼠40只，雌雄各半，按500 mg/kg BW（活菌含量為2.5×1014 CFU/g）的劑量經(jīng)腹腔注射DJB5菌液。腹腔注射后3、7和14 d分別取雌雄各3只解剖，并進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察。參照NY/T 2186.12012《微生物農(nóng)藥毒理學(xué)試驗(yàn)準(zhǔn)則》、GB 15193.3—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》和NY/T 1109—2017《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》，根據(jù)昆明小鼠有無(wú)死亡、中毒癥狀、病理學(xué)觀(guān)察及病理組織學(xué)檢查對(duì)病變進(jìn)行分級(jí)。

1. 2. 8 溶血試驗(yàn) 用接菌環(huán)蘸取DJB5菌種，于血瓊脂培養(yǎng)基上畫(huà)蛇形線(xiàn)接種，置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24±2 h后觀(guān)察有無(wú)溶血環(huán)，用金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[CMCC（B）26003]作陽(yáng)性對(duì)照。

1. 2. 9 一次破損皮膚刺激試驗(yàn) 取3只健康且皮膚完好的昆明小鼠，用手術(shù)刀片將小鼠背部脊柱兩側(cè)的毛去掉，去毛范圍為2.5 cm×2.5 cm，用75%酒精清潔并消毒暴露皮膚，用無(wú)菌手術(shù)刀片在兩塊皮區(qū)域內(nèi)各劃一個(gè)“井”形的破損傷口。取0.5 mL DJB5（5.4×1010 CFU/mL）菌液部分滴于其中一塊破損皮膚上，部分滴于2～4層無(wú)菌紗布上，并將紗布敷貼于破損皮膚表面，用醫(yī)用膠布固定，另一側(cè)破損皮膚用生理鹽水同樣處理作為對(duì)照，敷貼時(shí)間4 h。試驗(yàn)結(jié)束后，用溫水洗去殘留菌液，并于除去菌液后1、24和48 h觀(guān)察皮膚局部反應(yīng)。

1. 2. 10 急性眼刺激試驗(yàn) 將0.1 mL DJB5菌液（5.4×1010 CFU/mL）滴于昆明小鼠一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)以生理鹽水作同樣處理為正常對(duì)照，滴菌液后，將眼被動(dòng)閉合4 s，30 s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1、24、48和72 h，肉眼觀(guān)察昆明小鼠眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況。

1. 2. 11 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 參考NY/T 1109—2017《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》采用紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)生防菌對(duì)抗菌藥物的敏感性強(qiáng)度。藥敏紙片S1098含有青霉素G、氨芐西林、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素等10種抗菌藥物。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

昆明小鼠生化指標(biāo)、血常規(guī)、體重和臟器系數(shù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPASS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DJB5菌體對(duì)昆明小鼠的急性經(jīng)口毒性

以最大劑量（5000 mg/kg BW）一次性灌胃DJB5菌體后，昆明小鼠表現(xiàn)為拒食和少動(dòng)，6 h后發(fā)現(xiàn)昆明小鼠能正常飲食飲水，精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)不良反應(yīng)，連續(xù)飼養(yǎng)觀(guān)察14 d，處理昆明小鼠與對(duì)照比較，表現(xiàn)正常。解剖昆明小鼠進(jìn)行病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，灌胃DJB5菌體的昆明小鼠器官無(wú)病變現(xiàn)象;制作心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟5個(gè)器官的石蠟切片并進(jìn)行H-E染色，結(jié)果（圖1-c1～圖1-c5）顯示處理組昆明小鼠的器官與對(duì)照組無(wú)差異，表明DJB5菌體對(duì)昆明小鼠的急性經(jīng)口半致死劑量LD50>5000 mg/kg，DJB5的急性經(jīng)口毒性屬無(wú)毒級(jí)別。

2. 2 DJB5發(fā)酵上清液對(duì)昆明小鼠的急性經(jīng)口毒性

通過(guò)給昆明小鼠灌胃5和10倍的DJB5發(fā)酵上清濃縮液，并于處理后3和14 d檢查昆明小鼠的生理生化和血相指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1～表4。處理后3 d，昆明小鼠的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）明顯升高，其中10倍DJB5發(fā)酵上清液處理與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），其他幾項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）（表1）;處理后14 d，昆明小鼠的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均正常，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（表2）;處理后3和14 d，昆明小鼠的白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞等血項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（表3和表4）。

處理后14 d，解剖昆明小鼠觀(guān)察各臟器器官的顏色和形態(tài)，檢查病變情況，同時(shí)制作心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟5個(gè)器官的石蠟切片，并用H-E染色，在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果（圖1-b1～圖1-b5）表明，各處理組昆明小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照相比無(wú)明顯差異：昆明小鼠心肌細(xì)胞未見(jiàn)增大和萎縮，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)異常滲出物和出血現(xiàn)象;肝細(xì)胞形態(tài)正常，核圓、居中，細(xì)胞排列規(guī)則致密，以中央靜脈為中心向四周呈索狀排列;脾臟紅髓和白髓分界清晰，脾索和脾血竇結(jié)構(gòu)正常，脾臟淋巴細(xì)胞豐富;支氣管、肺泡等結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核質(zhì)比例正常，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血，肺間質(zhì)未見(jiàn)纖維組織增生;腎小體，腎小囊結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，腎小球上皮細(xì)胞無(wú)充血現(xiàn)象，腎近曲小管上皮細(xì)胞核圓形，且結(jié)構(gòu)正常。

2. 3 DJB5對(duì)昆明小鼠的急性腹腔注射致病性

腹腔注射DJB5菌體后，處理組昆明小鼠表現(xiàn)為少動(dòng)和不食的中毒癥狀，12 h后處理組昆明小鼠逐漸恢復(fù)正常狀態(tài)，連續(xù)觀(guān)察14 d，無(wú)小鼠死亡。在處理后第3、7和14 d分別取昆明小鼠解剖，并進(jìn)行病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示昆明小鼠各臟器無(wú)腫脹、變色、充血等病變現(xiàn)象;同時(shí)稱(chēng)量小鼠體重及心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等器官的重量，計(jì)算臟器系數(shù)，結(jié)果（圖2）表明處理組與對(duì)照組的小鼠體重和臟器系數(shù)均無(wú)顯著差異，生防菌DJB5對(duì)昆明小鼠無(wú)致病性。

2. 4 溶血性

溶血試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，金黃色葡萄球菌在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)明顯的溶血圈，而生防菌DJB5無(wú)溶血圈。

2. 5 DJB5對(duì)昆明小鼠破損皮膚的刺激性

用DJB5菌液處理昆明小鼠1 h后，處理組傷口有輕微紅腫，無(wú)紅斑和水腫現(xiàn)象，處理后24和48 h，紅腫消散，無(wú)感染跡象，新毛逐漸覆蓋傷口，表明DJB5對(duì)昆明小鼠皮膚表現(xiàn)為無(wú)刺激性級(jí)別。

2. 6 DJB5對(duì)昆明小鼠的眼部刺激性

用DJB5菌液處理昆明小鼠眼部，于處理后1、24、48和72 h觀(guān)察昆明小鼠的結(jié)膜、虹膜和角膜，發(fā)現(xiàn)虹膜正常，結(jié)膜未充血也無(wú)水腫，角膜無(wú)潰瘍形成或渾濁，由此判斷DJB5對(duì)昆明小鼠眼睛無(wú)刺激性。

2. 7 DJB5對(duì)抗菌藥物的敏感性

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DJB5對(duì)頭孢唑林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、青霉素、氯霉素G、慶大霉素、紅霉素和丁胺卡那等9種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的敏感性，但對(duì)氨芐西林不敏感（圖4和表5），DJB5對(duì)NY/T 1109—2017 《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》規(guī)定的9種抗菌藥物敏感，符合安全性要求。

3 討論

在我國(guó)，有關(guān)生防菌的安全性研究報(bào)道較少，本研究首次報(bào)道了貝萊斯芽孢桿菌的生物安全性問(wèn)題。本研究中，用10倍濃縮的DJB5發(fā)酵上清液處理昆明小鼠3 d后，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量與對(duì)照組相比顯著升高，表明發(fā)酵上清液干擾了小鼠的肝臟功能，但處理14 d后的生理生化指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，可能是昆明小鼠可通過(guò)自身的代謝作用去除生防菌的有害影響;另外，處理組昆明小鼠3和14 d的血相指標(biāo)均與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明發(fā)酵液進(jìn)入小鼠體內(nèi)不會(huì)引起感染，DJB5對(duì)昆明小鼠較安全。DJB5菌液對(duì)昆明小鼠的皮膚和眼睛刺激性試驗(yàn)、腹腔注射試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)也均顯示該菌株符合安全性要求。以上研究結(jié)論將為該菌株在玉米儲(chǔ)藏期作為黃曲霉生防菌劑的運(yùn)用打下基礎(chǔ)。

目前，我國(guó)對(duì)微生物菌劑的管理仍有待改進(jìn)，雖然已對(duì)微生物肥料和環(huán)保用微生物的安全性問(wèn)題發(fā)布了技術(shù)準(zhǔn)則（導(dǎo)則），但微生物菌劑的安全性仍未得到重視，甚至出現(xiàn)采用土壤中篩選出的病原微生物進(jìn)行污染防治研究的對(duì)象（田曄等，2011）。對(duì)于微生物農(nóng)藥的生物安全性，我國(guó)目前尚無(wú)相關(guān)的技術(shù)準(zhǔn)則和標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的NY/T 2186.1—2012《微生物農(nóng)藥毒理學(xué)試驗(yàn)準(zhǔn)則》給出了毒理學(xué)方面的試驗(yàn)方法及其評(píng)價(jià)，但該準(zhǔn)則并無(wú)微生物農(nóng)藥皮膚刺激性、溶血性及抗菌藥物敏感性等方面的測(cè)試指導(dǎo)。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DJB5對(duì)玉米黃曲霉的防治效果高達(dá)92%，且能在玉米種子中長(zhǎng)期定殖，具有在玉米貯存期防治黃曲霉的潛力（袁遠(yuǎn)等，2019），用于種子儲(chǔ)藏期黃曲霉防治的DJB5最終將與飼料玉米一起進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，該生防菌的生物安全性決定了其是否能安全應(yīng)用。微生物農(nóng)藥的安全性評(píng)價(jià)非常重要，因此，本研究主要參考了NY/T 1109—2017《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》。另外，生防菌DJB5是否會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生移位，對(duì)動(dòng)物是否具有慢性毒性和生育影響，也是微生物農(nóng)藥安全需要考察的重要方面，本課題組將在后期開(kāi)展相關(guān)研究，以期為該菌株的安全應(yīng)用提供更全面的保障。芽孢桿菌是一種較理想的生防微生物，在植物病害的生物防治中廣泛應(yīng)用，但隨著研究的深入，一貫被認(rèn)為安全的生物物質(zhì)不斷被報(bào)道威脅環(huán)境和環(huán)境生物，為保障食品安全和生態(tài)環(huán)境的安全，生防物質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)不容忽視，期待國(guó)家層面盡快發(fā)布微生物農(nóng)藥生物安全評(píng)價(jià)相關(guān)的方法技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)，以保障生防物質(zhì)在環(huán)境中的安全運(yùn)用。

4 結(jié)論

貝萊斯芽孢桿菌DJB5對(duì)昆明小鼠無(wú)毒、無(wú)致病性和刺激性，無(wú)溶血性，且對(duì)受試的青霉素G、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和氯霉素等9種抗菌藥物敏感，表明貝萊斯芽孢桿菌DJB5及其發(fā)酵液的生物安全性高，具有開(kāi)發(fā)成防治玉米貯藏期黃曲霉制劑的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）