雷麗娟　楊曉琴　周英　王慧娟　陳麗珍　俸婷婷

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2247-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.17

摘 要 目的：探討女貞子提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化及成骨細(xì)胞增殖的影響。方法：以1α，25-二羥基維生素D3誘導(dǎo)兔原代骨髓細(xì)胞獲取破骨細(xì)胞，經(jīng)女貞子醇提物和水煎物低、中、高劑量（均為2、20、200 mg/L）處理后，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性測(cè)定法檢測(cè)各組細(xì)胞裂解液中TRACP活性及細(xì)胞中TRACP陽性細(xì)胞數(shù)，采用甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)量及骨陷窩面積百分率。以L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松誘導(dǎo)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14細(xì)胞獲取成骨細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率，采用堿性磷酸酶（APK）活性測(cè)定法檢測(cè)各組細(xì)胞中APK活性。結(jié)果：經(jīng)不同劑量女貞子提取物處理后，TRACP陽性細(xì)胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)量及其面積均有不同程度的改變，其中女貞子醇提物各劑量組和水煎物高劑量組TRACP活性及陽性細(xì)胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)量及面積百分率，以及女貞子水煎物中劑量組TRACP活性及陽性細(xì)胞數(shù)、骨陷窩面積百分率均顯著降低或減少，而水煎物低劑量組細(xì)胞的骨吸收陷窩數(shù)量顯著增多（P<0.05或P<0.01）;女貞子提取物低、中劑量組細(xì)胞的相對(duì)增殖率以及提取物各劑量組細(xì)胞的APK活性均顯著升高，而女貞子提取物高劑量組細(xì)胞的相對(duì)增殖率均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：女貞子提取物可抑制破骨細(xì)胞的TRACP活性，改變破骨細(xì)胞的骨吸收功能和成骨細(xì)胞的增殖行為，并增加成骨細(xì)胞的APK活性。

關(guān)鍵詞 女貞子;醇提物;水煎物;破骨細(xì)胞;成骨細(xì)胞;骨吸收;分化;增殖

Effects of Ligustri lucidi Fructus Extract on the Differentiation of Osteoclasts and the Proliferation of Osteoblasts

LEI Lijuan1，2，3，YANG Xiaoqin1，2，3，ZHOU Ying2，3，4，WANG Huijuan2，3，CHEN Lizhen2，3，F(xiàn)ENG Tingting2，3，4（1. School of Pharmaceutical Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2. Research and Development Center for Medicinal and Edible Plant Resources of Guizhou， Guiyang 550025， China; 3. Medicinal and Edible Plant Resources Application and Development Engineering Laboratory of Guizhou， Guiyang 550025， China; 4. Pharmacy School， Guiyang College of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Ligustri lucidi Fructus extract on the differentiation of osteoclasts and the proliferation of osteoblasts. METHODS： Rabbit primary bone marrow cells were induced with 1a，25-Dihydroxyvitamin D3 to obtain osteoclasts. After treated with low-dose， medium-dose and high-dose of L. lucidi Fructus ethanol and water extract （both 2， 20， 200 mg/L）， TRACP activity determined method was used to detect the activity of TRACP in cell lysis solution and the number of TRACP positive cells. The number of celluar bone resorption lacunae and the percentage of bone lacunae area were detected by toluidine blue staining. Osteoblasts were obtained by L-ascorbic acid， β-sodium glycerophosphate and dexamethasone-induced subcloning 14 of cranial parietal anterior osteocytes in mice. MTT assay and APK activity assay were used to detect relative proliferation rate of cells and the activity of APK. RESULTS： After treated with different doses of L. lucidi Fructus extract， the number of TRACP positive cells， the number of bone resorption lacunae and their area were changed in varying degrees. TRACP activity， the number of its positive cells， the number of bone resorption lacunae and the percentage of bone lacunae area in different dosage groups of L. lucidi Fructus ethanol extract and high-dose of water extract; the TRACP activity， the number of its positive cells and the percentage of bone lacunae area in L. lucidi Fructus water extract medium-dose group were decreased significantly， while the number of bone resorption lacunae in L. lucidi Fructus water extract low-dose group was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The relative proliferation rate of cells in L. lucidi Fructus extract low-dose and medium-dose groups and APK activity of cells in extract groups were significantly increased， while the relative proliferation rate of cells were decreased significantly in L. lucidi Fructus ethanol extract and water extract high-dose groups （P<0.01）. CONCLUSIONS： L. lucidi Fructus extract can inhibit TRACP activity of osteoclasts， change the bone resorption function of osteoclasts and the proliferation behavior of osteoblasts and increase APK activity of osteoclasts.

KEYWORDS? ?Ligustri lucidi Fructus; Ethanol extract; Water decoction; Osteoclasts; Osteoblasts; Bone resorption; Differentiation; Proliferation

女貞子（Ligustri lucidi Fructus）為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果實(shí)，含有女貞子苷、洋橄欖苦苷、齊墩果酸、4-羥基-β-苯乙基-β-D-葡萄糖苷、樺木醇等活性成分[1]。該藥材性涼，味甘、苦，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之功效，可用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥，其主要藥理作用包括抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松（OP）、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、升高白細(xì)胞、保肝強(qiáng)心等[1-2]。其中，抗腫瘤、抗OP作用是該藥材近幾年研究的熱點(diǎn)之一。中醫(yī)認(rèn)為，骨由腎主導(dǎo)，治療OP應(yīng)從補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)腰健膝、益氣養(yǎng)血、活血化瘀等方面入手[3]。因此，女貞子及其活性成分具有被開發(fā)為抗OP藥物的潛力。

OP是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度下降，松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔和變薄導(dǎo)致骨脆性增加，容易發(fā)生骨折及骨痛為特征的全身性骨代謝疾病，其發(fā)病機(jī)制與破骨細(xì)胞分化增強(qiáng)以及成骨細(xì)胞增殖減弱有關(guān)[4]。破骨細(xì)胞在維持骨代謝平衡過程中可發(fā)揮重要作用，該細(xì)胞由骨髓細(xì)胞經(jīng)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）共同刺激后分化而成，其異常分化時(shí)可造成骨吸收過度而導(dǎo)致骨量減少，進(jìn)而引發(fā)OP[5]。成骨細(xì)胞則由間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育而成，可分泌細(xì)胞外基質(zhì)，在骨微環(huán)境下礦化為骨基質(zhì)，并進(jìn)一步分化成熟形成骨細(xì)胞，主要參與骨的形成以及骨損傷的修復(fù)過程[6-7]。由此可見，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和成骨細(xì)胞的增殖可作為治療OP的手段之一。鑒于此，本研究以1α，25-二羥基維生素D3[1α，25-（OH）2VitD3]誘導(dǎo)兔原代骨髓細(xì)胞獲得破骨細(xì)胞，以L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松誘導(dǎo)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞亞克隆14細(xì)胞（MC3T3-E1Subclone 14）獲得成骨細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上初步探討女貞子提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞增殖的影響，以期為女貞子防治OP提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

3111型CO2培養(yǎng)箱、1510型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;XD20-RFL型倒置熒光相差顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）;LGJ-12型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;WH-2型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

女貞子飲片（酒制，貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：110502）經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院熊源新教授鑒定為木犀科植物女貞（L. lucidum Ait.）的干燥成熟果實(shí)。

破骨細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基、成骨細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)分別為1148795、1510464）;甲苯胺藍(lán)染色液（批號(hào)：BCBG4799V）、胎牛血清（批號(hào)：140502）、L-抗壞血酸（批號(hào)：A7506）、β-甘油磷酸鈉（批號(hào)：G5422）、地塞米松對(duì)照品（批號(hào)：D1756，純度：≥98%）均購自美國Sigma公司;青霉素/鏈霉素雙抗（批號(hào)：20140718）、MTT試劑（批號(hào)：46170204106）均購自北京索萊寶科技有限公司;谷氨酰胺對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100968-201001，純度：100%）;1α，25-（OH）2VitD3對(duì)照品（批號(hào)：096M4039V，純度：≥98%）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）測(cè)試盒及其染色試劑盒（批號(hào)分別為20140805、SLBJ7300V）、堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒（批號(hào)：20150809）均購自日本Sigma公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20140803）、Tritonx-100裂解液（批號(hào)：M2528）均購自美國MP Biomedicals公司;4%中性甲醛溶液（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20160115）;胰酶（美國Amresco公司，批號(hào)：1812C306）;其余試劑均為分析純，水為自制純化水。

1.3 動(dòng)物

出生48 h內(nèi)的清潔級(jí)新西蘭乳兔，雌雄不限，體質(zhì)量（120±10）g，由貴陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)鵬程農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（黔）2012-001。

1.4 骨磨片與細(xì)胞

骨磨片（批號(hào)：20161015）由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所提供;MC3T3-E1Subclone 14細(xì)胞由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 女貞子提取物的制備

稱取女貞子飲片100 g，用75%乙醇加熱回流提取3次（1 000 mL/次），每次3 h，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得浸膏經(jīng)冷凍干燥后，即得女貞子醇提物樣品（15.23 g，提取率為15.23%）。另稱取女貞子飲片100 g，用水煎煮3次（1 000 mL/次），每次分別煎煮2.5、2、1.5 h，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，所得浸膏經(jīng)冷凍干燥后，即得女貞子水煎物樣品（23.83 g，提取率為23.83%）。上述提取物均置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 骨髓細(xì)胞的分離與誘導(dǎo)培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)方法[8]分離骨髓細(xì)胞：脫頸處死出生48 h內(nèi)的乳兔，于無菌條件下剝離其后肢脛骨和股骨，置于4 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.3）中，去除骨周圍的軟組織，將骨干置于破骨細(xì)胞α-MEM完全培養(yǎng)基（即含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗、1%谷氨酰胺的破骨細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基，下同）中，縱向剖開骨干，用無菌刀片輕刮其內(nèi)表面至顏色變白;將完全培養(yǎng)基及骨渣渦旋振蕩，過200目篩后制成細(xì)胞懸液，以1×106～2×106個(gè)/孔的密度接種至24孔板（可根據(jù)試驗(yàn)需要預(yù)先放置骨磨片）中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱（下同）中培養(yǎng)24 h;用PBS洗掉未貼壁的細(xì)胞，再加入含1×10-8 mol/L 1α，25-（OH）2VitD3的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，記為培養(yǎng)的第1天，之后每隔3天更換1次培養(yǎng)基，并采用自然沉降法[9]篩選出骨髓細(xì)胞（即形態(tài)統(tǒng)一，且呈梭狀分布者）。

2.3 女貞子提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

采用TRACP活性測(cè)定法檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長期的骨髓細(xì)胞適量，按5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板（勿需骨磨片）中，培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組，女貞子醇提物低、中、高劑量組（2、20、200 mg/L，按醇提物質(zhì)量計(jì)，以DMSO為溶劑;劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，下同），女貞子水煎物低、中、高劑量組（2、20、200 mg/L，以水煎物質(zhì)量計(jì)，以DMSO為溶劑;劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，下同），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。吸棄上清液，空白對(duì)照組加入含1×10-8 mol/L 1α，25-（OH）2VitD3的破骨細(xì)胞α-MEM完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物和1×10-8 mol/L 1α，25-（OH）2VitD3的破骨細(xì)胞α-MEM完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第8天，使用0.2%TritonX-100裂解液裂解各孔細(xì)胞30 min，取裂解液20 μL，按TRACP測(cè)試盒說明書處理后，使用酶標(biāo)儀于530 nm波長處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值，并參照測(cè)試盒說明書方法換算TRACP活性[每升裂解液與測(cè)試盒底物于37 ℃反應(yīng)1 min產(chǎn)生1 μmol游離酚即為1個(gè)活力單位（U/L）]。同時(shí)，將細(xì)胞以PBS清洗后，于4%中性甲醇溶液中固定1 min，再用水清洗，輕輕甩干后，參照TRACP染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，使用顯微鏡進(jìn)行觀察，記錄TRACP陽性細(xì)胞數(shù)（陽性細(xì)胞的胞漿呈紅色）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 女貞子提取物對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

采用甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)。按“2.3”項(xiàng)下方法分組、給藥、培養(yǎng)（需骨磨片），每隔2天更換1次培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第8天，棄去培養(yǎng)基，將骨磨片用PBS清洗后，于10%中性甲醛溶液中固定10 min，再用0.25 mol/L氨水超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）清洗3次，每次5 min;經(jīng)乙醇梯度脫水后，用1%甲苯胺藍(lán)染色，再用水清洗，自然晾干;使用顯微鏡進(jìn)行觀察，采用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)骨吸收陷窩（鏡下呈紫紅色）數(shù)量和骨陷窩面積百分率[骨陷窩面積百分率（%）=骨陷窩面積/整張骨磨片面積×100%]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 女貞子提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1Subclone l4細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板（勿需骨磨片）中，培養(yǎng)24 h后，用PBS洗掉未貼壁的細(xì)胞。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組，女貞子醇提物低、中、高劑量組，女貞子水煎物低、中、高劑量組，并設(shè)置不含細(xì)胞和藥物的陰性對(duì)照組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。吸棄上清液，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組加入成骨細(xì)胞α-MEM完全培養(yǎng)基（含50 μg/mL L-抗壞血酸、10 mmol/mL β-甘油磷酸鈉、10-8 mol/mL地塞米松的成骨細(xì)胞α-MEM培養(yǎng)基，下同）100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的成骨細(xì)胞α-MEM完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測(cè)各孔的A值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率[相對(duì)增殖率（%）=（給藥組平均A值-空白對(duì)照組平均A值）/（空白對(duì)照組平均A值-陰性對(duì)照組平均A值）×100%]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 女貞子提取物對(duì)成骨細(xì)胞APK活性的影響

采用APK活性測(cè)定法[10-11]檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1Subclone 14細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板（勿需骨磨片）中，培養(yǎng)24 h后，用PBS洗掉未貼壁的細(xì)胞。按“2.5”項(xiàng)下方法分組（不設(shè)置陰性對(duì)照組）、給藥，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，使用1%TritonX-100裂解液于4 ℃下裂解30 min。取各孔裂解后的細(xì)胞適量，按AKP測(cè)試盒說明書處理后，使用酶標(biāo)儀于520 nm波長處檢測(cè)各孔的A值;采用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞的蛋白濃度，并將A值換算AKP活性[每克組織蛋白與測(cè)試盒底物于37 ℃反應(yīng)15 min產(chǎn)生1 mg游離酚即為1個(gè)活性單位（U/g prot）]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 女貞子提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的影響

3.1.1 TRACP活性及其陽性細(xì)胞數(shù) 空白對(duì)照組TRACP陽性細(xì)胞較多，且體積較大。與空白對(duì)照組比較，各給藥組TRACP陽性細(xì)胞均有不同程度的減少;其中女貞子醇提物各劑量組和水煎物中、高劑量組細(xì)胞的TRACP活性均顯著降低，TRACP陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見圖1、表1。

3.1.2 骨吸收功能 空白對(duì)照組骨吸收陷窩數(shù)量較多，且面積較大。與空白對(duì)照組比較，各給藥組骨吸收陷窩數(shù)及面積均有不同程度的變化;其中，女貞子醇提物各劑量組和水煎物高劑量組細(xì)胞的骨吸收陷窩數(shù)量及骨吸收陷窩面積百分率，以及水煎物中劑量組細(xì)胞骨陷窩面積百分率均顯著減少或降低，而水煎物低劑量組細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)量顯著增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表1。

3.2 女貞子提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，女貞子醇提物和水煎物低、中劑量組細(xì)胞的相對(duì)增殖率（>0）均顯著升高，而兩者高劑量組細(xì)胞的相對(duì)增殖率（<0）均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見表2。

3.3 女貞子提取物對(duì)成骨細(xì)胞APK活性的影響

與空白對(duì)照組比較，女貞子醇提物和水煎物各劑量組細(xì)胞的APK活性均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見表2。

4 討論

現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子具有保肝、調(diào)節(jié)免疫、強(qiáng)心、抗炎、抗OP及抗腫瘤等作用，且其多種活性成分（如齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、環(huán)烯醚萜苷、酪醇特女貞苷等）都具有抗OP的活性[12-13]。目前學(xué)者普遍認(rèn)為，女貞子提取物可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、阻滯破骨細(xì)胞激活或增殖、抑制基質(zhì)金屬酶表達(dá)等途徑來發(fā)揮抗OP作用[14-15]，但目前尚鮮見其對(duì)破骨細(xì)胞分化及成骨細(xì)胞增殖影響的相關(guān)報(bào)道。

本研究以1α，25-（OH）2VitD3誘導(dǎo)兔原代骨髓細(xì)胞來獲取破骨細(xì)胞，以抗壞血酸、甘油磷酸鈉、地塞米松誘導(dǎo)MC3T3-E1Subclone 14細(xì)胞來獲取成骨細(xì)胞，初步探討了不同劑量女貞子醇提物和水煎物對(duì)破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能、破骨細(xì)胞增殖及相關(guān)酶活性的影響。1α，25-（OH）2VitD3是參與破骨細(xì)胞形成與激活過程的必要因子，可通過誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化而形成破骨細(xì)胞;同時(shí)，其可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（如骨髓單核細(xì)胞）形成陽性多核細(xì)胞，并使破骨細(xì)胞具有骨吸收功能[16]。其中，TRACP活性可用以衡量破骨細(xì)胞分化及其骨吸收能力，該酶被公認(rèn)為破骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶[17]。此外，骨吸收陷窩是破骨細(xì)胞骨吸收直接作用的結(jié)果，其數(shù)量及面積大小亦可直接反映破骨細(xì)胞的骨吸收功能[18]。為此，本研究考察了女貞子提取物對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的影響。結(jié)果顯示，女貞子醇提物及水煎液各劑量組TRACP陽性細(xì)胞、骨吸收陷窩數(shù)及面積均有不同程度的變化，其中女貞子醇提物各劑量組和水煎物高劑量組的TRACP活性及陽性細(xì)胞數(shù)、骨吸收陷窩數(shù)量及面積百分率，以及水煎物中劑量組的TRACP活性及陽性細(xì)胞數(shù)、骨吸收陷窩面積百分率均較空白對(duì)照組均顯著降低或減少，而水煎物低劑量組細(xì)胞的骨吸收陷窩數(shù)量顯著增多。這提示不同劑量女貞子提取物可不同程度地抑制破骨細(xì)胞分化，且醇提物和水煎物對(duì)其骨吸收功能的影響存在差異，這可能與提取物中的成分差異有關(guān)，但有待后續(xù)研究予以證實(shí)。

當(dāng)骨吸收大于骨形成時(shí)，可使機(jī)體骨量丟失從而導(dǎo)致OP等相關(guān)骨疾病的發(fā)生[4]。成骨細(xì)胞是骨形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其增殖可產(chǎn)生豐富的膠原基質(zhì)，并通過礦化作用形成更多的骨質(zhì)，因此調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖可能是治療OP的途徑之一[19]。MC3T3-E1Subclone 14細(xì)胞是一種亞克隆體，主要是由表型各異的MC3T3-E1細(xì)胞系分離克隆而得，其增殖行為與顱頂前成骨細(xì)胞類似，是體外研究的理想模型[20]。為此，本研究采用MC3T3-E1Subc- lone 14細(xì)胞誘導(dǎo)獲得成骨細(xì)胞，并考察了女貞子提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，女貞子提取物低、中劑量組細(xì)胞的相對(duì)增殖率（>0）均較空白對(duì)照組顯著升高，而提取物高劑量組細(xì)胞的相對(duì)增殖率（<0）均較空白對(duì)照組顯著降低。這提示不同劑量女貞子提取物可改變成骨細(xì)胞的增殖行為，且中、低劑量的女貞子提取物可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而高劑量則可抑制成骨細(xì)胞的增殖。APK是參與骨代謝的同源二聚體糖蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞的成熟與鈣化，被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志[21]，且由于該酶的表達(dá)也會(huì)隨著細(xì)胞分化而增強(qiáng)，故其活性也是評(píng)估成骨細(xì)胞增殖的指標(biāo)之一[22]。為此，本研究考察了女貞子提取物對(duì)APK活性的影響。結(jié)果顯示，女貞子醇提物和水煎物各劑量組細(xì)胞APK活性均較空白對(duì)照組顯著升高。這提示不同劑量女貞子提取物均可明顯提高成骨細(xì)胞中APK的活性。

綜上所述，女貞子提取物可抑制破骨細(xì)胞分化，并可改變破骨細(xì)胞的骨吸收功能和成骨細(xì)胞的增殖行為，可為女貞子的抗OP作用提供理論基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制、作用劑量和活性成分仍有待后續(xù)深入研究。

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（收稿日期：2018-10-11 修回日期：2019-05-10）

（編輯：張?jiān)拢?/p>