楊曉梅　陳曉蘭 　張永萍　楊芳芳　謝浪　楊敬鴻　羅成月　查華

中圖分類號(hào) R283.6;R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2206-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.09

摘 要 目的：考察不同劑量雪上一枝蒿總生物堿（簡(jiǎn)稱“雪總堿”）對(duì)膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠血清炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白表達(dá)的影響，并探討其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的可能機(jī)制。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組（復(fù)方醋酸地塞米松軟膏，0.2 g/kg）以及雪總堿低、中、高劑量組（56.26、112.50、225.00 mg/kg，以提取物中雪總堿的質(zhì)量計(jì)），每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均于左足皮下注射經(jīng)不完全費(fèi)氏佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原蛋白以復(fù)制CIA模型，并自造模當(dāng)日起于其左足涂抹相應(yīng)藥物，空白組和模型組大鼠涂抹等容65%乙醇，每日3次，連續(xù)28 d。于給藥第7、14、21、28天時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠左后足趾厚度，并計(jì)算足腫脹度;于末次給藥后采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組大鼠血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量，采用免疫組化法檢測(cè)其關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達(dá)水平[以免疫組化評(píng)分（HIS）表示];借助熵權(quán)法計(jì)算綜合評(píng)分，并以此評(píng)價(jià)不同給藥劑量對(duì)CIA模型大鼠上述指標(biāo)的影響。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的足腫脹度、血清炎癥因子含量以及HIS值均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠各時(shí)間點(diǎn)足腫脹度，陽性組和雪總堿高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及HIS值，雪總堿中劑量組血清L-6、TNF-α含量以及雪總堿低劑量組血清TNF-α含量均顯著降低（P<0.05）。各給藥組上述指標(biāo)的綜合評(píng)分分別為0.37（陽性組）、0.31（雪總堿高劑量組）、0.23（雪總堿中劑量組）、0.09（雪總堿低劑量組）。結(jié)論：雪總堿對(duì)CIA模型大鼠具有一定的改善作用，且有隨劑量升高而作用增強(qiáng)的趨勢(shì)。這種作用可能與降低大鼠血清中炎癥因子的含量以及抑制關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 雪上一枝蒿;總生物堿;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎模型;大鼠;炎癥因子;FOS蛋白;信息熵理論

Comparison of Improvement Effects and Its Mechanism of Different Doses of Total Alkaloids from Aconitum racemulosum on CIA Model Rats Based on Information Entropy Theory

YANG Xiaomei，CHEN Xiaolan，ZHANG Yongping，YANG Fangfang，XIE Lang，YANG Jinghong，LUO Chengyue，ZHA Hua（School of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of different doses of total alkaloids from Aconitum racemulosum （ARTA） on serum inflammation factors and FOS protein expression in synovial tissue of joint in collagen-induced arthritis （CIA） model rats， and to investigate its potential mechanism of anti-rheumatoid arthritis （RA）. METHODS： Male SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive group （Compound dexamethasone acetate ointment， 0.2 g/kg）， ARTA low-dose， medium-dose and high-dose groups （56.26， 112.50， 225.00 mg/kg， by the weight of ARTA in the extract）， with 10 rats in each group. Except for blank group， other groups were given subcutaneous injection of Bovine collagen Ⅱ emulsified with incomplete Freund’s adjuvant into the left foot to establish CIA model; the left foot were smeared with relevant medicine from the day of modeling. Blank group and model group were smeared with constant volume of 65% ethanol， 3 times a day， for consecutive 28 days. On the 7th， 14th， 21st and 28th day of administration， the thickness of left hind toe was measured with vernier caliper， and the degree of foot swelling was calculated. The serum contents of IL-1β， IL-6 and TNF-α in rats were measured by ELISA after last administration. The expression of FOS protein in synovial tissue was determined by immunohistochemical method [expressed by HIS]. The comprehensive score was conculated by entropy weight method. Effects of each dosage on above indexes of CIA model rats were evaluated with the comprehensive score. RESULTS： Compared with blank group， the degree of foot swelling， serum content of inflammatory factors and HIS value were increased significantly in model group （P<0.05）. Compared with model group， the degree of foot swelling in each administration group， serum contents of IL-1β， IL-6 and TNF-α， HIS in positive group and ARTA high-dose group， serum contents of IL-6 and TNF-α in ARTA medium-dose group as well as serum content of TNF-α in ARTA low-dose group were decreased significantly（P<0.05）. Comprehensive score of above indicators were 0.37（positive group）， 0.31（ARTA high-dose group）， 0.23（ARTA medium-dose group） and 0.09（ARTA low-dose group）. CONCLUSIONS： ARTA can improve CIA model rats， and the effect tends to increase with the increase of dose. Above effect may be associated with reducing serum content of inflammatory factors and inhibiting the expression of FOS protein in synovial tissue.

KEYWORDS? ?Aconitum racemulosum; Total alkaloids; Rheumatoid arthritis; Collagen-induced arthritis model; Rat; Inflammatory factors; FOS protein; Information entropy theory

雪上一枝蒿為毛茛科植物短柄烏頭（Aconitum brachypodum Diels）、鐵棒錘（A. pendulum Busch）和宣威烏頭（A. subrosullatum H-M.）的干燥塊根，具祛風(fēng)除濕、通利關(guān)節(jié)之功效，是貴州、云南等地的民間用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[1]。生物堿類成分是該藥材的有效組分，也是其毒性成分，故其治療量與中毒量十分相近[2]。經(jīng)皮給藥為含有毒性成分藥材的常用給藥方式，具有無肝臟首關(guān)效應(yīng)、生物利用度高、給藥方便等優(yōu)勢(shì)。本課題組前期藥理研究表明，雪總堿具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[3]，但尚未見其對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）治療作用的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究以膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠為對(duì)象，通過檢測(cè)其足腫脹度以及血液中相關(guān)炎癥因子的含量和關(guān)節(jié)滑膜組織中c-fos基因表達(dá)產(chǎn)物FOS蛋白的表達(dá)水平，從炎癥因子和分子蛋白水平等方面探討雪總堿對(duì)CIA模型大鼠的改善作用及可能機(jī)制，并借助信息熵理論綜合評(píng)價(jià)不同劑量雪總堿對(duì)上述指標(biāo)的影響，以期為其外用新劑型的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Multlskan Mk3型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司];BX51T-PHD-J11型顯微鏡（日本Olympus公司）;CMIA98A型圖像分析儀（美國(guó)Media Cybermetics公司）;HC-2062型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）;AUY220型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

雪總堿提取物（本實(shí)驗(yàn)室自制;每100 g藥材共提取雪總堿1.32 g，提取率為1.32%）;復(fù)方醋酸地塞米松軟膏（陽性對(duì)照，華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1718004H，規(guī)格：復(fù)方）;不完全弗氏佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白（北京博蕾德生物科技有限公司，批號(hào)分別為150514、150374）;鼠源C-FOS抗體（圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：00058736）;大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)：1218E18）和蘇木精染色劑均購(gòu)自南京賽博生物科技有限公司;DAB顯色劑（北京索萊寶科技有限公司）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 大鼠造模

將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于醋酸溶液中，4 ℃攪拌過夜，待其充分溶解后，加入等體積的不完全弗氏佐劑，充分混勻、乳化，制成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的牛Ⅱ型膠原蛋白乳劑。于大鼠左足皮下注射上述乳劑0.1 mL進(jìn)行免疫，14 d后避開上次免疫部位再以相同劑量注射1次以加強(qiáng)免疫。

2.2 大鼠分組與給藥

所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組（復(fù)方醋酸地塞米松軟膏，0.2 g/kg）和雪總堿低、中、高劑量組（56.26、112.50、225.00 mg/kg，以提取物中雪總堿的質(zhì)量計(jì)），每組10只。各給藥組給藥劑量經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]并參照本課題組前期急性毒性試驗(yàn)[5]確定。除空白組外，其余各組大鼠均按“2.1”項(xiàng)下方法復(fù)制CIA大鼠模型。自造模當(dāng)日（即第1次注射后，下同）起，各給藥組大鼠均于左足涂抹相應(yīng)藥物（陽性組藥物為直接涂抹，雪總堿各劑量組藥物以65%乙醇稀釋后涂抹），空白組和模型組大鼠均于左足涂抹等容65%乙醇，每日3次，連續(xù)28 d。

2.3 大鼠足腫脹度檢測(cè)

分別于造模前和給藥第7、14、21、28天時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠左后足趾厚度并計(jì)算足腫脹度，足腫脹度=（給藥后足趾厚度-造模前足趾厚度）/給藥后足趾厚度。

2.4 大鼠血清炎癥因子含量檢測(cè)

末次給藥1 h后，于大鼠腹主動(dòng)脈取血適量，以5 000 r/min離心10 min，分離血清。使用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.5 大鼠滑膜組織中FOS蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取血后，將大鼠固定，用75%乙醇擦拭膝關(guān)節(jié)后，沿膝關(guān)節(jié)正中切開皮膚，暴露并打開關(guān)節(jié)腔，用眼科鑷將滑膜組織輕輕夾住，用刀片將其完整切下，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，包埋、切片（3～5 μm）、脫蠟。切片滴加鼠源C-FOS抗體適量，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染后，封片，于顯微鏡下觀察。在滑膜組織切片中分別選取左上、左下、右上、右下、中央等5個(gè)視野，采用圖像分析儀進(jìn)行FOS陽性顆粒計(jì)數(shù)（陽性顆粒呈淺棕色或深棕色），并以免疫組化評(píng)分（HIS）表示FOS蛋白的表達(dá)水平（HIS=陽性顆粒評(píng)分×陽性細(xì)胞染色程度，式中，陽性顆粒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)——0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強(qiáng)陽性;染色程度量化標(biāo)準(zhǔn)（以染色面積百分比計(jì)）——0分為染色面積百分比0～1%，1分為>1%～10%，2分為>10%～50%，3分為>50%～80%，4分為>80%～100%[6]）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.6.1 方差分析 采用SPSS 19.00軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方法分析，兩組間比較采用LSD分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6.2 熵權(quán)法分析 采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行熵權(quán)法分析。將各試驗(yàn)組數(shù)據(jù)的均值（V）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，進(jìn)一步計(jì)算各考察指標(biāo)的信息熵（H），并賦予相應(yīng)權(quán)重（W），最終計(jì)算綜合評(píng)分（M），根據(jù)M值評(píng)價(jià)不同劑量雪總堿對(duì)各指標(biāo)的影響（M值越大，表示其對(duì)相應(yīng)指標(biāo)的影響越大）[7]。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠足腫脹度檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的足腫脹度均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的足腫脹度均顯著減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，模型組和各給藥組大鼠足腫脹度均于給藥第14天達(dá)到峰值，并于給藥第21天開始下降，詳見表1。

3.2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性組和雪總堿高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，雪總堿中劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α含量以及雪總堿低劑量組大鼠血清TNF-α含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表2。

3.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠HIS值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性組、雪總堿高劑量組大鼠HIS值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表2。

3.4 基于熵權(quán)法的雪總堿抗RA效應(yīng)評(píng)價(jià)

取模型組和各給藥組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的V值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，空白組不作分析。其中，當(dāng)指標(biāo)較模型組升高時(shí)，按V標(biāo)準(zhǔn)化值=V給藥組-V模型組計(jì)算;當(dāng)指標(biāo)較模型組降低時(shí)，按V標(biāo)準(zhǔn)化值=V模型組-V給藥組計(jì)算[8-10]，足腫脹度以給藥第28天的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

根據(jù)上述概率矩陣計(jì)算第i個(gè)指標(biāo)的熵值（Hi），得Hi=[0.92 0.93 0.98 0.99 0.86]。參考文獻(xiàn)方法[8-9]計(jì)算Wi，得Wi=[0.256 0.214 0.069 0.021 0.441]。按公式計(jì)算m組n個(gè)指標(biāo)的Mm=P1mW1+P2mW2+……+PnmWn計(jì)算，得各組的M值分別為0.37（陽性組）、0.31（雪總堿高劑量組）、0.23（雪總堿中劑量組）、0.09（雪總堿低劑量組）。

4 討論

雪上一枝蒿是云南、貴州等地民間用于治療風(fēng)濕疼痛、關(guān)節(jié)炎、跌打損傷的要藥之一[11]?，F(xiàn)有研究表明，雪總堿有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[3]，但其對(duì)RA的治療作用尚未見相關(guān)報(bào)道。CIA誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的病理特征為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨侵蝕破壞，與RA發(fā)病過程類似[12]。為此，本研究考察了雪總堿對(duì)CIA模型大鼠的改善作用及可能機(jī)制。復(fù)方醋酸地塞米松軟膏是臨床治療RA的常用外用制劑，療效顯著[13]，故本研究以其作為陽性對(duì)照藥物。

本研究在考察大鼠足腫脹度基礎(chǔ)上，對(duì)其血清炎癥因子的含量和關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。其中，IL-1β、IL-6、TNF-α作為免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，在RA的發(fā)展過程中具有重要作用。研究表明，IL-1β可在RA早期誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞趨化，同時(shí)誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生[14];IL-6可使滑膜炎癥加劇，并誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，其在RA患者血清中的含量顯著高于健康者[15]。TNF-α的含量與RA患者血清中類風(fēng)濕因子滴度、紅細(xì)胞沉降率和C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)呈正相關(guān)，是反映病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一[16-17]。此外，RA的病理表現(xiàn)以滑膜組織異常增生為主，是一種自身免疫功能下降的慢性疼痛性疾病，疼痛可誘發(fā)c-fos基因在中樞神經(jīng)內(nèi)的異常表達(dá)，使得FOS蛋白的表達(dá)明顯上升[13，18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠足腫脹度（給藥第7、14、21、28天）、血清炎癥因子含量、HIS值均較空白組顯著升高，提示大鼠血清炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達(dá)均明顯升高，表明模型復(fù)制成功。與模型組比較，各給藥組大鼠各時(shí)間點(diǎn)足腫脹度，陽性組和雪總堿高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及HIS值，雪總堿中劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α含量以及雪總堿低劑量組大鼠血清TNF-α含量均顯著降低，提示雪總堿可明顯緩解大鼠的足腫脹情況，其機(jī)制可能與降低其血清炎癥因子的含量以及抑制關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達(dá)有關(guān)。

信息熵是系統(tǒng)不確定和無序性的度量，信息熵理論可將每個(gè)因素作為一個(gè)隨機(jī)變量，計(jì)算其對(duì)應(yīng)的H值，并賦予相應(yīng)權(quán)重，以評(píng)價(jià)各受試因素的綜合影響[19]。熵權(quán)法以信息熵理論為依據(jù)，客觀地對(duì)各因素進(jìn)行賦權(quán)，并進(jìn)行綜合評(píng)分，可為多指標(biāo)研究數(shù)據(jù)分析提供依據(jù)[20]。本研究嘗試借助信息熵理論建立綜合評(píng)價(jià)度量指標(biāo)，探討不同劑量雪總堿對(duì)大鼠足腫脹度、血清中炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，高劑量雪總堿對(duì)CIA模型大鼠各考察指標(biāo)的綜合影響最大、中劑量次之、低劑量最弱，提示雪總堿改善RA的作用有隨劑量升高而增強(qiáng)的趨勢(shì)，但整體均弱于陽性對(duì)照藥物。

綜上所述，雪總堿對(duì)RA具有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能與降低血清中炎癥因子的含量以及抑制關(guān)節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達(dá)有關(guān)。但本研究并未對(duì)與抑制RA炎癥反應(yīng)的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行研究，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以完善。

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（收稿日期：2019-01-06 修回日期：2019-06-10）

（編輯：張?jiān)拢?/p>