馮華 劉亮 王祥培 劉順美

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0232-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.18

摘 要 目的：建立黔產(chǎn)苗藥對坐葉藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18，流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為235 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為15 μL。以蘆丁為參照，測定10批貴州不同地區(qū)對坐葉藥材的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進行共有峰指認和相似度評價。結(jié)果：10批對坐葉藥材的HPLC指紋圖譜有12個共有峰，相似度均大于0.90。經(jīng)驗證，10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：本研究所建HPLC指紋圖譜可為對坐葉藥材的鑒別和質(zhì)量評價提供參考。

關(guān)鍵詞 黔產(chǎn)苗藥；對坐葉；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Miao medicine Hedyotis uncinella from Guizhou. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Eclipse XDB C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 235 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 15 μL. Using rutin as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of H. uncinella from different areas of Guizhou province were determined. Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprints （2004A edition） was used to identify common peaks and evaluate similarity. RESULTS： There were 12 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of H. uncinella， and the similarity was higher than 0.90. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of sample were in agreement with control fingerprints. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprints can provide reference for the identification and quality evaluation of H. uncinella.

KEYWORDS Miao medicine from Guizhou； Hedyotis uncinella； HPLC； Fingerprint

苗藥對坐葉為茜草科植物對坐葉（Hedyotis uncinella Hook. et Arn.）的干燥全草，為貴州苗藥。對坐葉味辛、微苦，性平，具有清熱解毒、調(diào)中止瀉的功效，可用于治療腹瀉、腹脹、腹痛、里急后重以及痢疾、急性胃炎。苗藥解毒止瀉膠囊，由苗藥對坐葉為主藥組成中藥復方制劑。目前該產(chǎn)品主要在遵義家誠藥業(yè)生產(chǎn)，苗藥解毒止瀉膠囊用于胃腸濕熱所致的腹瀉、腹脹、腹痛、急性腸炎等癥狀，作為地方藥材標準被收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》（2003年版）[1]。現(xiàn)行標準僅通過性狀、顯微、薄層對對坐葉藥材進行質(zhì)量控制。本文對對坐葉藥材進行高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，并對10批不同產(chǎn)地來源對坐葉藥材進行了相似度評價比較，建立HPLC指紋圖共有模式，以期為對坐葉藥材的質(zhì)量控制和有效識別提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-1260型HPLC儀，包括四元泵、二極管陣列檢測器、柱溫箱、自動進樣器、Agilent 1260工作站（美國Agilent 公司）；AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機（功率：500 W，頻率：60 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；111型中藥粉碎機（上海海久中藥機械制造有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

對坐葉藥材采集于貴州各地區(qū)，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W校劉亮副教授鑒定為茜草科植物對坐葉（Hedyotis uncinella Hook.et Arn.）的干燥全草。藥材來源及信息見表1。蘆丁對照品（批號：100080-200707，純度：100%，購于中國食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%A→10%A；5～15 min，10%A→15%A；15～25 min，15%A→20%A；25～35 min，20%A→30%A；35～40 min，30%A→5%A；40～45 min，5%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：235 nm；進樣量為15 μL；運行時間：45 min[2-6]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取對坐葉藥材粉末（過3號篩）約1.0 g，置于錐形瓶中，加甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，取出，放置至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液（編號：S4）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以14號峰蘆丁為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對保留峰面積的RSD分別為1.5%和2.1%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號：S4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以14號峰蘆丁為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對保留峰面積的RSD分別為1.4%和2.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批樣品（編號：S4）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以14號峰蘆丁為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對保留峰面積的RSD分別為1.7%和2.3%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜生成 取10批對坐葉藥材各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）對10批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1～圖3。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）進行相似度評價結(jié)果顯示，10批對坐葉藥材樣品的相似度均大于0.90，且與對照指紋圖譜具有較好的一致性，表明藥材樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見表2～表4。

2.4.3 HPLC指紋圖譜相關(guān)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版），對10批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進行比較分析。結(jié)果顯示，10批藥材樣品有12個共有峰，其中14號峰（蘆丁）峰面積大，且為所有藥材樣品共有，確定其為參照峰。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

采用HPLC儀的二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，以確定樣品的吸收波長。結(jié)果，在225、235 、254 nm波長處吸收較強。采用多波長進樣分析，結(jié)果在235 nm波長下所得基線較穩(wěn)定、色譜峰較多、信息豐富，故選擇235 nm為檢測波長。

3.2 提取方法的選擇

以甲醇為提取溶劑，分別考察超聲提取、回流提取、浸漬提取這3種提取方法。分別進樣后，從色譜圖信息分析，3種提取法制備的供試品溶液圖譜信息未見明顯差異。綜合考慮，選定操作更簡便的超聲提取方法來制備供試品溶液。

3.3 流動相的選擇

在對供試品溶液進行HPLC分析時，本課題組分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等流動相體系對色譜分離過程的影響[3-6]。結(jié)果顯示，乙腈-0.20%磷酸溶液的分離度高，峰形對稱，基線穩(wěn)定。

3.4 梯度洗脫的時間確定

以乙腈-0.20%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，分別考察了樣品在40、50、60、70 min洗脫時間的色譜圖[7]。結(jié)果顯示，45 min后圖譜基線穩(wěn)定，無其他峰出現(xiàn)，故選擇梯度洗脫時間為45 min為宜。

3.5 產(chǎn)地的選擇

通過查詢?nèi)珖胁菟庂Y源普查信息和課題組成員到貴州各地區(qū)藥材采集信息情況，發(fā)現(xiàn)對坐葉藥材主要分布在貴州安順、黔東南州、黔南州、銅仁地區(qū)。由于藥材生長受環(huán)境、氣候、地理條件等影響，以及指紋圖譜研究要求樣本應在10批次以上，所以本試驗研究采集樣品10批，其中有2批是在同一個縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集。

3.6 參照峰的選擇

對坐葉藥材主要成分為黃酮類[8-10]，而黃酮類主要包括槲皮素、熊果酸、木犀草素、蘆丁。通過色譜定位，14號峰為蘆丁，其峰面積大，且為所有藥材樣品共有，故確定其為參照峰。

3.7 指紋圖譜分析

通過建立該指紋圖譜，對10批對坐葉藥材HPLC圖譜進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥材HPLC圖譜的共有峰保留時間、相對峰面積非常吻合，與共有模式R比較，相似度均大于0.90。從各峰面積大小來看，峰面積有很大的差異，可能與藥材生長環(huán)境有關(guān)。從共有峰可以確定10批對坐葉藥材有效成分具有一致性。

綜上，本研究所建HPLC指紋圖譜可為對坐葉藥材的鑒別和質(zhì)量評價提供參考。

參考文獻

[ 1 ] 貴州省食品藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準：2003年版[S].貴陽：貴州科技出版社，2003：149.

[ 2 ] 周建良，齊煉文，李萍.色譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的應用[J].色譜，2008，26（2）：153-159.

[ 3 ] 馮華，鄧麗娟，吳林菁，等.酢漿草高效液相色譜指紋圖譜的鑒別研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（10）：2414-2416.

[ 4 ] 馮華，聶明華，羅秀瓊，等.土知母藥材及其混淆品HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（6）：67-69.

[ 5 ] 馮華，石尚友，羅秀瓊，等.黔產(chǎn)見血清藥材薄層色譜與HPLC指紋圖譜識別[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（10）：2423-2425.

[ 6 ] 馮華，石尚友，羅秀瓊，等.黔產(chǎn)大菟絲子藥材高效液相色譜指紋圖譜的鑒別研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（3）：634-635.

[ 7 ] 馮華，楊燁，王祥培，等.艾納香及其偽品假東風草的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2017，28（9）：1257-1261.

[ 8 ] 劉亞華，徐君，李齊激，等.對坐葉化學成分研究[J].中成藥，2013，35（3）：556-559.

[ 9 ] 徐君，吳連花，徐文芬，等.HPLC法測定對坐葉中齊墩果酸和熊果酸[J].中成藥，2012，34（4）：765-767.

[10] 陳華國，靳鳳云，趙超，等.HPLC法測定對坐葉中木犀草素的含量[J].中國藥房，2009，20（36）：2838-2839.

（收稿日期：2018-02-24 修回日期：2018-11-08）

（編輯：余慶華）