鄧香

中圖分類號 R730.264；R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0211-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.14

摘 要 目的：探討粉防己堿（TET）對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和遷移、侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。方法：以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）方法檢測濃度分別為0（空白對照）、2.5、5、10、15、20 μmol/L的TET對細(xì)胞增殖的影響；采用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，考察正常對照組（TET濃度為0 μmol/L）和TET組（10 μmol/L，IMR-32細(xì)胞；15 μmol/L，SH-SY5Y細(xì)胞）的細(xì)胞跨膜情況；采用Western blotting法檢測按上述濃度TET處理后的IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK3β）、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：5、10、15、20 μmol/L的TET可顯著降低IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的存活率（P<0.05或P<0.01），其半數(shù)抑制濃度分別為10.148、14.461 μmol/L。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，TET組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P<0.01）；Western blotting法檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，TET組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、β-catenin、p-GSK3β蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：TET對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和遷移、侵襲能力具有明顯的抑制作用，其機(jī)制與下調(diào)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)及抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 粉防己堿；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；IMR-32細(xì)胞；SH-SY5Y細(xì)胞；增殖；遷移；侵襲

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of tetrandrine （TET） on the proliferation and migration， invasion ability of neuroblastoma cells and its mechanism. METHODS： Human neuroblastoma cell lines IMR-32 and SH-SY5Y were chosen as objects. MTT assay was used to detect the effects of 0 （blank control）， 2.5， 5， 10， 15， 20 μmol/L TET on cell proliferation. The transmembrane number of normal control group （TET concentration of 0 μmol/L） and TET group （10 μmol/L for IMR-32 cells， 15 μmol/L for SH-SY5Y cells） were investigated by Transwell cell migration and invasion experiments. The protein levels of MMP-2， MMP-9， β-catenin， GSK3β and p-GSK3β in IMR-32 cells and SH-SY5Y cells were tested by Western blotting assay after treated with TET of above concentrations. RESULTS： TET with 5， 10， 15， 20 μmol/L can reduce the survival rate of IMR-32 cells and SH-SY5Y cells significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC50 of which to IMR-32 cells and SH-SY5Y cells were 10.148 and 14.461 μmol/L， respectively. Results of migration and invasion experiments showed that compared with normal control group， the number of transmembrane cells was decreased significantly in TET group （P<0.01）. Results of Western blotting assay showed that compared with normal control group， the protein expression levels of MMP-2，MMP-9，β-catenin and p-GSK3β were decreased significantly in TET group （P<0.01）. CONCLUSIONS： TET shows significant inhibitory effects on the proliferation， migration and invasion ability of neuroblastoma cells， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of MMP-2 and MMP-9 and inhibiting Wnt/β-catenin signaling pathway.

KEYWORDS Tetrandrine； Neuroblastoma； IMR-32 cell； SH-SY5Y cell； Proliferation； Migration； Invasion

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma，NB）是兒童常見的惡性實(shí)體腫瘤，其起源于交感神經(jīng)神經(jīng)嵴，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤；由于NB具有較高的異質(zhì)性，且其存在惡性程度高、生長迅速、容易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，故患者治療效果差、預(yù)后差[1]。目前NB的治療手段主要包括手術(shù)切除、化療、放療、骨髓/造血干細(xì)胞移植及生物治療等，但一旦NB患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，則其病死率極高[2]。

粉防己堿（Tetrandrine，TET）屬于雙芐基異喹啉類生物堿，是從粉防己的根塊中提取出的有效成分，在治療高血壓、心律不齊、關(guān)節(jié)炎、炎癥甚至矽肺等方面發(fā)揮著重要作用[3-4]；此外，其在抗腫瘤如肝癌[5]、胃癌[6]、膀胱癌[7]及腎癌[8]等方面也具有一定功效。研究表明，TET主要通過直接的細(xì)胞毒性作用、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、保護(hù)正常組織免受放射損傷以及抗轉(zhuǎn)移、抗血管再生等途徑發(fā)揮較好的抗腫瘤作用，其主要作用機(jī)制可能是激活線粒體死亡通路，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。但TET 用于NB治療的相關(guān)研究報(bào)道較少。

IMR-32和SH-SY5Y細(xì)胞系來源于人NB細(xì)胞系，其在細(xì)胞形態(tài)和功能上與正常人神經(jīng)細(xì)胞有較多相似之處，因而成為顱內(nèi)腫瘤研究的重要細(xì)胞模型之一[10]。本研究以這類細(xì)胞系為研究對象，考察TET對NB細(xì)胞的增殖以及遷移、侵襲能力的影響，并通過檢測信號通路相關(guān)蛋白水平的變化探討TET抑制NB細(xì)胞的作用機(jī)制，以期為TET臨床用于治療NB以及探索新的NB治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

VIOS 160i型 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（上海晶安生物科技有限公司）；JIDI-17R型微量高速冷凍離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；BDS200型倒置光學(xué)顯微鏡（北京奧特偉業(yè)光學(xué)儀器有限公司）；DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀（上海珂準(zhǔn)儀器有限公司）；HCB1502型電子天平（英國ADAM公司）。

1.2 藥品與試劑

TET對照品（批號：T2695，純度：≥98%）、青霉素、鏈霉素（美國Sigma-Aldrich公司）；1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP-2）兔單抗、MMP-9兔單抗（美國Santa Cruz公司）；β-catenin兔單抗、糖原合成激酶3β（GSK3β）兔單抗、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）兔單抗（美國CST公司）；β-actin抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體（二抗，北京博爾西科技有限公司）；胰酶（廣州碧云天有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司）；多聚甲醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；TBST緩沖液、結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑、BCA試劑（美國Pierce公司）；蛋白上樣緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格；pH 7.2磷酸緩沖鹽溶液（PBS）為實(shí)驗(yàn)室自制；水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將IMR-32細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基（以下各試/實(shí)驗(yàn)步驟相同），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每隔2～3 d進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長至80%～90%融合度時使用胰酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。

2.2 TET對NB細(xì)胞的毒性作用考察

采用MTT法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞，按8 000個/孔接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁生長后吸棄培養(yǎng)基，加入終濃度分別為0（空白對照）、2.5、5、10、15、20 μmol/L 的TET甲醇溶液，每種濃度設(shè)置5個復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；吸棄上清液，分別加入含1 mg/mL MTT的培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h；培養(yǎng)完畢后吸棄上清液，加入DMSO 150 μL，置于振蕩器上振蕩10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處檢測細(xì)胞光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（OD試驗(yàn)組/OD空白對照組）×100%。

2.3 TET對NB細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響考察

2.3.1 NB細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞并分為正常對照組、TET組，經(jīng)胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個/mL。在Transwell上室加入細(xì)胞懸液200 μL，然后根據(jù)TET細(xì)胞毒性考察結(jié)果分別加入終濃度為0 μmol/L（正常對照組）、10 μmol/L（IMR-32細(xì)胞，TET組）或15 μmol/L（SH-SY5Y細(xì)胞，TET組）的TET甲醇溶液；下室加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基800 μL。各組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出小室用棉簽擦拭上室，以4%多聚甲醛固定15 min，再以0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉簽擦拭上室。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)挑選5個不同視野，拍照并計(jì)數(shù)跨膜細(xì)胞。

2.3.2 NB細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取Matrigel基質(zhì)膠，以無血清培養(yǎng)基按照體積比8 ∶ 1稀釋，按50 μL/孔均勻鋪在Transwell小室上室，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置4～6 h待凝固。取對數(shù)生長期的IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法分組，并按“經(jīng)胰酶消化……0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉簽擦拭上室”等步驟同法操作。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)挑選5個不同視野，拍照并計(jì)數(shù)跨膜細(xì)胞。

2.4 TET對NB細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響考察

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法分組，經(jīng)胰酶消化，1 500 r/min離心15 min后以4.0×105個/mL接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0 μmol/L（正常對照組）、10 μmol/L（IMR-32細(xì)胞，TET組）或15 μmol/L（SH-SY5Y細(xì)胞，TET組）的TET甲醇溶液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。使用RIPA裂解液裂解并提取總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度以確定上樣濃度。所獲蛋白以上樣緩沖液×6作變性處理后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，110 V電壓轉(zhuǎn)膜；使用5%脫脂奶粉封閉1 h，加MMP-2抗體（1 ∶ 1 000）、MMP-9抗體（1 ∶ 1 000）、β-catenin抗體（1 ∶ 1 000）、GSK3β抗體（1 ∶ 1 000）、p-GSK3β抗體（1 ∶ 1 000）及β-actin抗體（1 ∶ 2 000），在4 ℃下?lián)u床孵育過夜；次日用TBST緩沖液漂洗10 min×3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記抗體（二抗，1 ∶ 8 000），搖床上慢速常溫孵育1 h；TBST緩沖液漂洗10 min×3次，加入ECL試劑顯影。采用Quantity One 4.6.4分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白比較所得的相對灰度值表示目的蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TET對NB細(xì)胞的細(xì)胞毒性

結(jié)果顯示，不同濃度的TET對IMR-32細(xì)胞和SH- SY5Y細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并隨TET濃度增加該抑制作用有增強(qiáng)趨勢。與空白對照比較，當(dāng)TET濃度為5～20 μmol/L時，細(xì)胞存活率隨著藥物濃度的增加而顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；TET對IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為10.148、14.461 μmol/L。根據(jù)IC50數(shù)據(jù)，并考慮到盡量減少藥物自身對腫瘤細(xì)胞的毒性作用，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中TET對IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的處理濃度分別設(shè)為10、15 μmol/L。不同濃度TET作用后IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y 細(xì)胞的存活率見圖1。

3.2 TET對NB細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

3.2.1 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，正常對照組 IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的跨膜數(shù)分別為（163.02±6.24）個、（118.13±7.50）個，TET組IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的跨膜數(shù)分別為（68.32±3.51）個、（61.24±5.03）個。與正常對照組比較，TET組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組NB細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯微圖見圖2，跨膜細(xì)胞數(shù)柱形圖見圖3。

3.2.2 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，正常對照組IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的跨膜數(shù)分別為（401.43±10.96）個、（182.28±5.56）個，TET組IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的跨膜數(shù)分別為（206.12±8.83）個、（83.35±3.60）個。與正常對照組比較，TET組跨膜細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組NB細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯微圖見圖4，跨膜細(xì)胞數(shù)柱形圖見圖5。

3.3 TET對NB細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對照組比較，TET組IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組NB細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)電泳圖見圖6，蛋白表達(dá)水平柱形圖見圖7。

3.4 TET對NB細(xì)胞中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β的蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對照組比較，TET組IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中β-catenin、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；但各組間GSK3β的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組NB細(xì)胞中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)電泳圖見圖8，蛋白表達(dá)水平柱形圖見圖9。

4 討論

NB是兒童常見的惡性腫瘤疾病，嚴(yán)重威脅兒童生命健康。目前常用的手術(shù)、化療、放療、移植及生物治療等方法并不能有效控制疾病，因此積極尋找新的NB治療方法對于提高患者生存率、改善預(yù)后具有重要意義。粉防己作為傳統(tǒng)中藥具有悠久的藥用史，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，粉防己中的有效成分TET在體外和體內(nèi)均具有抗多種腫瘤的活性[11]。然而關(guān)于TET對NB的抗腫瘤作用卻研究甚少。本研究結(jié)果顯示，使用不同濃度的TET處理后，能明顯抑制IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，且隨TET濃度增加該抑制作用呈增強(qiáng)趨勢；Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TET能顯著抑制NB細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

MMPs家族在NB侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要功能。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MMPs是鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[12]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成員，兩者均屬于明膠酶，能降解明膠和Ⅳ型膠原蛋白。在NB發(fā)生、發(fā)展過程中，MMP-2和MMP-9能促進(jìn)NB的侵襲、遷移[13]。本研究結(jié)果顯示，TET處理能顯著降低IMR-32細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平。

Wnt/β-catenin信號通路是生物體內(nèi)廣泛存在的信號傳導(dǎo)途徑，在NB發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其中β-catenin和GSK3β是該信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[14]。當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路被激活時，無法形成降解復(fù)合物，因此無法降解β-catenin，從而使β-catenin能轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、組織形成等相應(yīng)生理學(xué)改變；相反，當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路失活時，β-catenin被降解而無法發(fā)揮生物學(xué)功能[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，中藥成分如姜黃素可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移[17]。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，TET能抑制p-GSK3β和β-catenin的蛋白表達(dá)，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在TET抑制NB的遷移和侵襲過程中可能起到關(guān)鍵作用；但TET對GSK3β的蛋白表達(dá)未見明顯影響，這可能與GSK3β蛋白在不同狀態(tài)下磷酸化位點(diǎn)不同有關(guān)[18]。

綜上所述，TET能抑制NB細(xì)胞增殖及遷移、侵襲能力，而下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平和抑制Wnt/β-catenin信號通路是其可能的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2018-06-26 修回日期：2018-12-04）

（編輯：段思怡）