張志瑞 李喜香 李盛華 李季文 畢映燕 王雪梅

中圖分類號 R283 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0192-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.10

摘 要 目的：建立祛寒逐風顆粒中藁本內(nèi)酯的含量測定方法，并優(yōu)化其中揮發(fā)油提取工藝及包合工藝。方法：采用高效液相色譜法測定藁本內(nèi)酯的含量，色譜柱為Waters C18，流動相為甲醇-水（70 ∶ 30，V/V），流速為1 mL/min，檢測波長為327 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL；以揮發(fā)油得率、藁本內(nèi)酯含量為考察指標，以浸泡時間、加水量、提取時間為考察因素，采用正交試驗設計優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝；以包合率、包合物收得率、包合物得油率為考察指標，以揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例、包合溫度、包合時間為考察因素，采用正交試驗設計優(yōu)化揮發(fā)油包合工藝。結果：藁本內(nèi)酯進樣量線性范圍為0.4～4 μg（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于2%（n=6）；加樣回收率為96.75%～102.03%（RSD=2.06%，n=6）。最優(yōu)揮發(fā)油提取工藝為加入10倍量水（mL/g）、浸泡15 min、提取8 h，所得平均揮發(fā)油得率為0.310 7%，平均藁本內(nèi)酯含量為0.418 0 mg/g；最優(yōu)揮發(fā)油包合工藝為揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1 ∶ 8（mL/g）、包合溫度50 ℃、包合時間3 h，所得平均包合率為69.43%，平均包合物收得率為58.89%，平均包合物得油率為14.15%。結論：所建含量測定方法操作簡便、準確，穩(wěn)定性較好；優(yōu)化所得揮發(fā)油提取工藝及包合工藝穩(wěn)定、可行。

關鍵詞 祛寒逐風顆粒；揮發(fā)油；β-環(huán)糊精；藁本內(nèi)酯；高效液相色譜法；正交試驗；提取工藝；包合工藝

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of ligustilide and to optimize the extraction technology of volatile oil and inclusion technology in Quhan zhufeng granules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （70 ∶ 30， V/V） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 327 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using yield of volatile oil and the content of ligustilide as index， with soaking time， the amount of adding water and extraction time as factors， the extraction technology was optimized by orthogonal test. Using inclusion rate， the yield of inclusion compound and yield of volatile oil as index， with ratio of volatile oil to β-cyclodextrin， inclusion temperature and inclusion time as factors， the inclusion technology of volatile oil was optimized by orthogonal test. RESULTS： The linear range of ligustilide was 0.4-4 μg（r=0.999 9）； RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. The recoveries were 96.75%-102.03%（RSD=2.06%，n=6）. The optimal extraction technology of volatile oil included 10-fold water （mL/g）， soaking for 15 min， extracting for 8 h. Average yield of volatile oil was 0.310 7%， and average content of ligustilide was 0.418 0 mg/g. The optimal inclusion technology of volatile oil included ratio of β-cyclodextrin and volatile oil was 1 ∶ 8 （mL/g）； inclusion temperature was 50 ℃； inclusion time was 3 h. Average inclusion rate was 69.43%， and the yield of inclusion compound was 58.89%； the yield of volatile oil was 14.15%. CONCLUSIONS： Established determination method is simple， accurate and stable. The optimal extraction technology of volatile oil and inclusion technology are stable and feasible.

KEYWORDS Quhan zhufeng granules； Volatile oil； β-cyclodextrin； Ligustilide； HPLC； Orthogonal test； Extraction technology； Inclusion technology

祛寒逐風合劑是由白術、川芎、細辛、花椒等11味中藥材組成的復方制劑，具有溫經(jīng)祛寒、祛風除濕、通絡止痛的功效，臨床上常用于治療風濕性、類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、肩周炎、頸椎病等[1]。本課題組在多年的制劑生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，祛寒逐風合劑存在儲存攜帶不便、相對密度不穩(wěn)定等缺點，經(jīng)過多次劑型篩選，擬將其劑型改為顆粒劑。處方中白術、川芎、細辛、花椒中所含的揮發(fā)油成分是其主要的藥效成分[2-6]，為了保證祛寒逐風顆粒臨床療效及揮發(fā)油在顆粒劑中的穩(wěn)定性，本研究建立了其中藁本內(nèi)酯的含量測定方法，并采用正交試驗設計法對揮發(fā)油提取工藝和β-環(huán)糊精包合工藝進行了優(yōu)化，旨在為其相關研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Altus-A10型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱和Empower3工作站（美國Perkin Elmer公司）；ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）；DZF-300型真空恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；ETS-D5型集熱式恒溫磁力攪拌器[艾卡（廣州）儀器設備有限公司]；360EP型、125SM型電子天平（德國Satorius公司）；Nikon E 200型顯微鏡[成貫儀器（上海）有限公司]；M5960型揮發(fā)油測定器（上海市崇明建設玻璃儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

藁本內(nèi)酯對照品（上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：4431-01-0 ，純度：99.8%）；β-環(huán)糊精（陜西禮泉化工有限實業(yè)公司，批號：006001，純度：>99%）；甲醇為色譜醇，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

麩炒白術飲片（批號：180301）、細辛飲片（批號：180502）均購于甘肅隴脈有限公司；川芎飲片（批號：20170901）、川椒飲片（批號：20170901）均購于甘肅省金羚集團藥業(yè)有限公司。上述藥材經(jīng)甘肅省食品藥品檢定研究院宋平順主任藥師分別鑒定為菊科植物白術（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根莖、馬兜鈴科植物單葉細辛（Asarum himalaicum）的干燥根和根莖、傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖、蕓香科植物花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）的干燥成熟果皮。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（70 ∶ 30，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取藁本內(nèi)酯對照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取麩炒白術15 g、細辛15 g、川芎15 g、川椒10 g，浸泡15 min后，按2015年版《中國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法（甲法）[7]提取揮發(fā)油。精密量取揮發(fā)油30 μL，置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取除川芎外的其他藥材樣品，按“2.1.3”項下方法制備缺川芎的陰性樣品溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在此色譜條件下，各成分峰均可達到基線分離，理論板數(shù)按藁本內(nèi)酯峰計均大于5 000，陰性樣品溶液對待測物的測定無干擾。

2.1.6 線性關系考察 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液5、10、20、30、50 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以藁本內(nèi)酯進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得藁本內(nèi)酯回歸方程為y=2×106x-547.25（r=0.999 9）。結果表明，藁本內(nèi)酯進樣量線性范圍為0.4～4 μg。

2.1.7 精密度試驗 取“2.1.2”項下對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，藁本內(nèi)酯峰面積的RSD為1.26%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，藁本內(nèi)酯峰面積的RSD為1.48%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.9 重復性試驗 取各味藥材樣品適量，共6份，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，藁本內(nèi)酯的平均含量為0.674 0 mg/g，RSD為1.82%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的各味藥材樣品1.25 mg，共 6份，分別加入藁本內(nèi)酯對照品溶液15.38 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.1.11 樣品含量測定 取各味藥材樣品適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定9次，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，藁本內(nèi)酯含量范圍為0.300 9～1.576 7 mg/g。

2.2 揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

2.2.1 揮發(fā)油提取與分離 按處方比例稱取川芎、白術、川椒、細辛4味藥材，浸泡15 min后按2015年版《中國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法（甲法）[7]提取揮發(fā)油至揮發(fā)油測定器內(nèi)體積無變化，靜置過夜，用乙醚萃取3次至水層無色，合并乙醚液，加無水硫酸鈉脫水，揮發(fā)至無乙醚味，濾過，稱定質(zhì)量，密閉保存。揮發(fā)油得率=揮發(fā)油質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

2.2.2 單因素試驗 以對病癥具有療效的物質(zhì)為評價原則，結合各指標的理化性質(zhì)，選擇藁本內(nèi)酯含量、揮發(fā)油得率為指標，確定浸泡時間（A）、加水量（B）、提取時間（C）3個因素的試驗范圍，結果見表2、表3。

由表3可確定3個因素的3個水平依次為：浸泡時間15、30、45 min，加水量10、12、14倍（mL/g），提取時間4、6、8 h。

2.2.3 正交試驗設計優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝 在單因素試驗的基礎上，以浸泡時間（A）、加水量（B）、提取時間（C）為考察因素，每個因素取3個不同水平，以藁本內(nèi)酯含量、揮發(fā)油得率為指標，按L9（34）正交試驗設計進行試驗，因素與水平見表4，正交試驗設計與結果見表5，方差分析結果見表6（綜合評分=藁本內(nèi)酯含量/最大藁本內(nèi)酯含量×70%+揮發(fā)油得率/最大揮發(fā)油得率×30%）。

由表6的方差分析結果可知，因素C對提取工藝有顯著影響（P<0.05），各因素對揮發(fā)油提取工藝的綜合評分影響程度大小為C>B>A，即提取時間>加水量>浸泡時間。最優(yōu)提取工藝條件為A1B1C3，即加入10倍量水（mL/g），浸泡15 min，提取8 h。

2.2.4 驗證試驗 按處方比例的8倍量稱取川芎、白術、細辛、川椒，共3份，每份440 g，按最優(yōu)提取工藝條件進行試驗驗證，平行操作3次，結果見表7。

2.3 揮發(fā)油包合工藝優(yōu)化

2.3.1 包合物制備方法的選擇 包合物常用的制備方法有飽和水溶液法、研磨法和超聲法[8]，分別對3種包合方法進行考察，結果見表8[包合率（%）=包合物中含油質(zhì)量/（揮發(fā)油投入質(zhì)量×空白回收率）×100%；包合物收得率（%）=包合物實際質(zhì)量/（β-環(huán)糊精質(zhì)量+揮發(fā)油投入質(zhì)量）×100%；得油率（%）=包合物中含油質(zhì)量/包合物實際質(zhì)量×100%；空白回收率（%）=收集揮發(fā)油質(zhì)量/揮發(fā)油投入量×100%]。

由表8可知，飽和水溶液法的包合率、包合物收得率和得油率均高于研磨法和超聲法，故選擇飽和水溶液法制備包合物。

2.3.2 正交試驗設計優(yōu)化揮發(fā)油包合工藝 在預試驗的基礎上，參考相關文獻[9-10]，以揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）為考察因素，每個因素取3個不同水平，以包合率、包合物收得率、得油率為指標，按L9（34）正交試驗設計進行試驗，因素與水平見表9，正交試驗設計與結果見表10，方差分析結果見表11[綜合評分=（揮發(fā)油包合率/最大揮發(fā)油包合率）×60%+（包合物收得率/最大包合物收得率）×20%+（得油率/最大得油率）×20%]。

由表11的方差分析結果可知，因素A、B對揮發(fā)油包合工藝有顯著影響（P<0.05），各因素對揮發(fā)油包合工藝的綜合評分影響程度大小為A>B>C，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例>包合溫度>包合時間。最優(yōu)包合工藝條件為A2B3C3，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例為1 ∶ 8（mL/g），包合溫度為50 ℃，包合時間為3 h。

2.3.3 驗證試驗 按最優(yōu)揮發(fā)油提取工藝條件制備揮發(fā)油，再按最優(yōu)揮發(fā)油包合工藝條件進行驗證試驗，平行操作3次，結果見表12。

2.4 揮發(fā)油包合物鑒別

取β-環(huán)糊精、揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物、β-環(huán)糊精包合物適量，分別放于3張載玻片上，以少量甘油分散溶解，蓋上蓋玻片，于100倍顯微鏡下觀察[11]，結果見圖2。圖2A中β-環(huán)糊精呈較規(guī)則結晶狀；圖2B中揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物與β-環(huán)糊精相似，且有分散的油滴存在；圖2C中包合物結晶明顯消失，呈不規(guī)則粉末狀，提示揮發(fā)油包合物形成。

3 討論

有文獻報道，在制劑制備工藝中揮發(fā)油成分大多直接噴灑在顆粒上，以致?lián)]發(fā)油揮發(fā)、氧化，穩(wěn)定性差，且其質(zhì)量不易控制，從而影響療效[12-13]。本研究采用β-環(huán)糊精對揮發(fā)油進行包合，此工藝操作簡單、流程短，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

經(jīng)預試驗發(fā)現(xiàn)，采用飽和水溶液法進行包合時，由于揮發(fā)油易漂浮在β-環(huán)糊精飽和水溶液的表面，以致包合不完全，因此需先用一定量的無水乙醇稀釋后再進行包合，這可降低揮發(fā)油的附著性，增強揮發(fā)油在β-環(huán)糊精飽和水溶液中的分散性，有利于更充分地包合。

β-環(huán)糊精是由7個葡萄糖分子形成的筒狀大環(huán)化合物，其除可與脂溶性藥物形成分子包合物而增加藥物的水溶性外，還可以掩蓋藥物的不良氣味。本試驗采用顯微鑒別后發(fā)現(xiàn)，β-環(huán)糊精為晶體狀，包合物為粉末狀，提示揮發(fā)油與β-環(huán)糊精形成穩(wěn)定的包合物。

綜上所述，優(yōu)化所得揮發(fā)油提取工藝及包合工藝穩(wěn)定、可行；所建含量測定方法操作簡便、準確，穩(wěn)定性較好。

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（收稿日期：2018-08-22 修回日期：2018-11-16）

（編輯：陳 宏）