李鳴 石博妹 張鑫 等

摘要：【目的】探究RFRP-3對大鼠附睪生殖功能的影響，為全面了解RFRP-3調(diào)控雄性動(dòng)物的生殖生理功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^半定量RT-PCR檢測不同發(fā)育階段（20、40、60和80日齡）SD大鼠附睪中RFRP-3及其受體GPR147的表達(dá)情況;選取60日齡雄性SD大鼠，分別對其睪丸注射0（CK）、0.1、1.0和10.0 μg/d的RFRP-3，連續(xù)注射7 d，然后通過組織石蠟切片、酶活性測定、Western blotting等分別檢測不同劑量RFRP-3對SD大鼠附睪形態(tài)學(xué)、Caspase-3活性、凋亡相關(guān)蛋白（Caspase-3和Bcl-2）和自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3和Atg5）表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】RFRP-3和GPR147在不同發(fā)育階段SD大鼠附睪中的表達(dá)水平呈波動(dòng)性變化，均以60日齡的表達(dá)水平最高;不同劑量的RFRP-3均能導(dǎo)致SD大鼠附睪上皮細(xì)胞發(fā)生異常，使精子數(shù)量減少。與CK相比，不同劑量的RFRP-3均能極顯著增加SD大鼠附睪Caspase-3活性（P<0.01，下同），還能顯著（P<0.05，下同）或極顯著提高附睪中活化Caspase-3與完整Caspase-3的比值，有效抑制Bcl-2的表達(dá)，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。RFRP-3對SD大鼠附睪內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1、LC3-II/LC3-I和Atg5的表達(dá)出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果?！窘Y(jié)論】RFRP-3在雄性大鼠附睪中有表達(dá)，但對附睪活性有直接抑制作用，具體作用原理是RFRP-3能誘導(dǎo)附睪中總Caspase-3裂解為活性Caspase-3并下調(diào)Bcl-2表達(dá)以觸發(fā)附睪細(xì)胞凋亡，而附睪細(xì)胞的凋亡促使附睪退化及精子數(shù)量減少。

關(guān)鍵詞： 大鼠;RFRP-3;附睪;生殖功能;凋亡相關(guān)蛋白;自噬相關(guān)蛋白

中圖分類號： S865.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0405-07

Abstract：【Objective】 In order to provide theoretical basis for a comprehensive understanding of RFRP - 3 contro-lling on reproductive physiology function of the male animals， the study analyzed the effect of RFRP-3 on reproductive function of rats epididymis. 【Method】Semi-quantitative RT-PCR was used to study the expression of RFRP-3 and its receptor GPR147 in epididymis of different day-age（20， 40， 60 and 80 day-age） SD rats. 60 day-age male SD rats were selected and testis injection of 0（CK）， 0.1， 1.0， and 10.0 μg/d RFRP-3 were conducted on them respectively for continuous 7 d. Tissue paraffin section， enzyme activity detection and Western blotting were used to measure the epididymis morphology， Caspase-3 activity and the expression of apoptosis-related protein（Caspase-3 and Bcl-2） and autophagy-related protein（Beclin-1， LC3， Atg5） of epididymis injected with different doses of RFRP-3. 【Result】The result of Semi-quantitative RT-PCR suggested that RFRP-3 and GPR147 expressed in a fluctuating way during different development stages and had the highest expression level at 60-day-old in rat epididymis.? Different doses of RFRP-3 could all induce rat epididymal cell? abnormalities and reduce sperm counts. Compared with CK， the activities of Caspase-3 in epididymis injected with different doses of RFRP-3 were extremely increased（P<0.01， the same below）. Different doses of RFRP-3 could significantly（P<0.05， the same below） or extremely increase the ratio of cleaved Caspase-3/whole-Caspase-3，? inhibit the expression of Bcl-2 protein， and presented obvious dose-dependent feature. RFRP-3 provided conflicting results on expression of autophagy marker proteins Beclin-1， LC3-II/LC3-I and Atg5 in rat epididymis. 【Conclusion】RFRP-3 expresses in male rat epididymis，but inhibit its activity directly. RFRP-3 can promote the decomposition of whole-Caspase-3 into activated-Caspase-3 and downregulate the expression of Bcl-2 protein. RFRP-3 induces epididymis apoptosis， and then leads to epididymis degradation and sperm count decrease.

Key words： rat; RFRP-3; epididymis; reproductive function; apoptosis-associated protein; autophagy-associated protein

0 引言

【研究意義】促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是日本Tsutsui團(tuán)隊(duì)在鵪鶉腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種C端具有RF酰胺結(jié)構(gòu)的新型神經(jīng)肽，能抑制垂體促性腺激素釋放（Tsutsui et al.，2000）。此后，在哺乳動(dòng)物上也發(fā)現(xiàn)具有RF酰胺結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，并將這種RF酰胺肽命名為RF相關(guān)肽（RFRP），其中RFRP-3與鳥類的GnIH生理作用一致，二者同源，G蛋白偶聯(lián)受體147（G-protein coupled receptor 147，GPR147）為RFRP-3的特異受體（Hinuma et al.，2000;Ubuka et al.，2012）。因此，從附睪水平探索RFRP-3對雄性動(dòng)物生殖功能的影響，可為研究RFRP-3調(diào)控動(dòng)物的生殖生理功能提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RFRP-3是目前在下丘腦中發(fā)現(xiàn)的唯一HPG軸抑制因子，在哺乳動(dòng)物中RFRP-3神經(jīng)元主要分布在下丘腦背內(nèi)側(cè)核，通過抑制促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）活性及黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）釋放，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物機(jī)體的生殖功能和性行為（Anderson et al.，2009;Ducret et al.，2009;Wu et al.，2009）。在雄性動(dòng)物中，RFRP-3及其受體在豬、獼猴和敘利亞倉鼠睪丸中的表達(dá)量較高，在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、生精小管、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中也有分布，與精子的形成密切相關(guān)（Hinuma et al.，2000;龔金秋等，2017）。發(fā)情期雌性小鼠和豬的卵巢顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞中也有RFRP-3表達(dá)，提示RFRP-3與卵泡發(fā)育有關(guān)（Li et al.，2013）。附睪是雄性生殖系統(tǒng)中的重要器官，哺乳動(dòng)物的精子需在附睪中經(jīng)歷一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能變化才能成熟并具有潛在受精能力（Martin-DeLeon，2015;Sullivan，2015;肖娟等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，鮮見RFRP-3與雄性動(dòng)物附睪中細(xì)胞凋亡及自噬關(guān)系的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過檢測不同發(fā)育階段大鼠附睪中RFRP-3和GPR147 mRNAs的表達(dá)情況，然后通過體內(nèi)試驗(yàn)檢測不同劑量RFRP-3對大鼠附睪形態(tài)學(xué)、凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探究RFRP-3對大鼠附睪生殖功能的影響，為全面了解RFRP-3調(diào)控雄性動(dòng)物的生殖生理功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

從廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買兩對剛性成熟的SPF級SD大鼠作為親本，在恒溫（22 ℃）干凈的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Gol-den View核酸染料、DL2000 DNA Marker購自Vazyme公司，瓊脂糖凝膠購自南京生興生物技術(shù)有限公司，二甲苯、伊紅染液和蘇木素染液均購自Solarbio公司，蛋白Marker購自Thermo公司，BSA購自Sigma公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，β-actin、Caspase-3、Bcl-2、Beclin-1、LC3和Atg5一抗和二抗均購自Cell Signaling Technology公司。RFRP-3、GAPDH和GPR147引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。

1. 2 半定量RT-PCR擴(kuò)增

分別選取20、40、60和80日齡的SD大鼠子代作為試驗(yàn)動(dòng)物，每組6只。將大鼠處死后摘取雙側(cè)附睪，按照TRIzol說明提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測不同日齡SD大鼠附睪中RFRP-3和GPR-147 mRNA的表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行適當(dāng)循環(huán)（表1）;最后72 ℃延伸10 min。取10.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。半定量RT-PCR引物及反應(yīng)條件如表1所示。

1. 3 附睪石蠟組織切片制作

選取24只60日齡雄性SD大鼠，體重350±10 g/只，隨機(jī)均分為4組，對SD大鼠睪丸進(jìn)行RFRP-3注射，注射劑量分別為0（CK）、0.1、1.0和10.0 μg/d，連續(xù)注射7 d。試驗(yàn)第8 d處死SD大鼠并剖解摘除附睪，將一側(cè)附睪固定在中性福爾馬林中（另一側(cè)凍存用于后續(xù)試驗(yàn)），固定后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、包埋和切片（厚度約5 μm）。經(jīng)HE染色后，將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察附睪中各種類型細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量，每個(gè)樣品制作5個(gè)切片，每個(gè)切片取2個(gè)視野在400倍鏡下進(jìn)行觀察。

1. 4 Caspase-3活性測定

取注射不同劑量RFRP-3的附睪樣品約50 μg，按Caspase-3活性檢測試劑盒說明，用酶標(biāo)儀（λ=405 nm）測定各組樣品的吸光度，通過計(jì)算OD試驗(yàn)/ODCK的倍數(shù)確定Caspase-3活性，每組重復(fù)6次。

1. 5 凋亡和自噬相關(guān)蛋白Western blotting檢測

解凍不同劑量組的SD大鼠附睪組織樣品。取約100 μg樣品置于1.5 mL的EP管中，加入1.0 mL RIPA裂解液后勻漿裂解;裂解后4 ℃下12000 r/min離心5 min，收集沉淀;取2.0 μL蛋白樣品用分光光度計(jì)測量其濃度，其余蛋白樣品按1%比例加入FMSF后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩８鲃┝拷M取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、麗春紅染色、脫脂牛奶封閉后，分別孵育一抗（活化Caspase-3、完整Caspase-3、Bcl-2、Beclin-1、Atg-5和LC3抗體，稀釋比均為1∶1000）和二抗（辣根過氧化酶標(biāo)記的抗羊或抗小鼠IgG，稀釋比1∶10000），加入ECL化學(xué)發(fā)光液，按時(shí)曝光，掃描膠片進(jìn)行灰度分析。每組重復(fù)6次。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 RFRP-3和GPR147在不同日齡SD大鼠附睪中的表達(dá)情況

如圖1所示， 20、40和80日齡SD大鼠附睪內(nèi)的RFRP-3 mRNA表達(dá)水平無顯著差異（P>0.05，下同）， 60日齡SD大鼠附睪內(nèi)的RFRP-3 mRNA表達(dá)水平最高且極顯著高于其他日齡（P<0.01，下同）。GPR147在不同日齡SD大鼠附睪中的表達(dá)情況與RFRP-3一致，也表現(xiàn)為60日齡的mRNA表達(dá)水平最高，且極顯著高于20、40和80日齡，而20、40和80日齡間無顯著差異。

2. 2 RFRP-3對SD大鼠附睪組織形態(tài)的影響

與CK（圖2-A和圖2-B）相比，經(jīng)0.1和1.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪上皮細(xì)胞發(fā)生變性，甚至出現(xiàn)空泡化，附睪管內(nèi)精子數(shù)量減少（圖2-C、圖2-D、圖2-E和圖2-F）;經(jīng)10.0 μg/d劑量處理后SD大鼠附睪出現(xiàn)不完整的柱狀上皮，附睪管內(nèi)精子數(shù)量明顯減少（圖2-G和圖2-H）。此外，經(jīng)不同劑量的RFRP-3處理后均能引起SD大鼠附睪內(nèi)腔中多核巨細(xì)胞剝脫且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

2. 3 RFRP-3對SD大鼠附睪Caspase-3活性的影響

與CK相比，不同劑量的RFRP-3均能極顯著增加SD大鼠附睪Caspase-3活性，且Caspase-3活性的增加呈劑量依賴關(guān)系（圖3）。

2. 4 RFRP-3對SD大鼠附睪凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，以完整Caspase-3、活化Caspase-3、Bcl-2和β-actin為一抗時(shí)，分別在36、17、26和45 kD附近出現(xiàn)明顯的條帶（圖4-A）。經(jīng)0.1和1.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中活化Caspase-3與完整Caspase-3的比值顯著高于CK處理（P<0.05，下同），而經(jīng)10.0 μg/d RFRP-3處理后其比值極顯著高于CK處理（圖4-B），說明RFRP-3能有效提高SD大鼠附睪Caspase-3活性，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系。此外，與CK相比，經(jīng)0.1和1.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中Bcl-2的相對表達(dá)量均顯著降低，而經(jīng)10.0 μg/d RFRP-3處理后Bcl-2的相對表達(dá)量極顯著降低（圖4-C），說明RFRP-3能有效抑制SD大鼠附睪中Bcl-2的表達(dá)，且這種抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。

2. 5 RFRP-3對大鼠附睪自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，以Beclin-1和Atg5為一抗時(shí)，分別在60和55 kD附近顯示出單一條帶;而以LC3為一抗時(shí)在14和16 kD附近出現(xiàn)2條免疫反應(yīng)條帶（圖5-A）。與CK相比，經(jīng)0.1 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中Beclin-1的相對表達(dá)量極顯著降低，1.0 μg/d劑量組的相對表達(dá)量顯著降低，但經(jīng)10.0 μg/d RFRP-3處理后其相對表達(dá)量極顯著升高（圖5-B），即RFRP-3對SD大鼠附睪中Beclin-1的表達(dá)呈低濃度抑制高濃度促進(jìn)作用。RFRP-3對SD大鼠附睪中Atg5的表達(dá)也表現(xiàn)出低濃度抑制高濃度促進(jìn)作用，經(jīng)0.1 μg/d RFRP-3處理后Atg5的相對表達(dá)量較CK極顯著降低，而在1.0 μg/d劑量組中的相對表達(dá)量顯著增加，10.0 μg/d劑量組中的相對表達(dá)量極顯著增加（圖5-C）。此外，與CK相比，經(jīng)1.0和10.0 μg/d RFRP-3處理后SD大鼠附睪中LC3-II/LC3-I顯著升高（圖5-D），說明一定濃度的RFRP-3能有效提高SD大鼠附睪LC3活性。

3 討論

至今，有關(guān)GnIH/RFRP-3的研究主要集中于其表達(dá)分布。Hinuma等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的下丘腦、眼及睪丸組織中均有RFRP-3 mRNA表達(dá);Zhang等（2010）研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、卵巢和睪丸組織中均有GnIH mRNA表達(dá)。本研究也證實(shí)，RFRP-3和GPR147在不同日齡的SD大鼠附睪中均有表達(dá)?？梢?，GnIH/RFRP-3不僅分布在動(dòng)物的中樞系統(tǒng)，在其外周組織同樣存在廣泛分布。此外，有研究表明RFRP-3和GPR147的表達(dá)情況在睪丸不同發(fā)育階段呈波動(dòng)變化（Ubuka et al.，2006;Zhao et al.，2010;Anjum et al.，2014）;本研究結(jié)果也顯示60日齡SD大鼠附睪中RFRP-3和GPR147的表達(dá)水平最高，與雄性大鼠的性成熟和精子成熟期基本吻合，故推測RFRP-3在大鼠附睪精子成熟過程中發(fā)揮重要作用。

GnIH/RFRP-3可直接作用于性腺，且與動(dòng)物性腺組織形態(tài)學(xué)的變化有密切關(guān)系。Ubuka等（2006）通過滲透泵將GnIH持續(xù)作用于性成熟的雄性鵪鶉，2周后發(fā)現(xiàn)GnIH呈劑量依賴性地抑制血清中的LH和睪酮分泌，同時(shí)誘導(dǎo)雄性鵪鶉睪丸生殖細(xì)胞凋亡，在形態(tài)學(xué)上縮小了生精小管直徑，抑制精子產(chǎn)生。Singh和Krishna（2010）在小鼠中也獲得類似的研究結(jié)論，即RFRP-3能增加異常竇腔卵泡的數(shù)量，但減少卵巢中黃體的數(shù)量。由于RFRP-3和GPR147 mRNA在大鼠附睪中均有表達(dá)，故推測RFRP-3可直接作用于大鼠附睪。根據(jù)本研究的石蠟切片觀察結(jié)果可知，不同劑量組中RFRP-3均可導(dǎo)致SD大鼠附睪管中的精子數(shù)量減少，與GnIH在雄性鵪鶉上的作用效果（Ubuka et al.，2006）一致，但精子數(shù)量減少的具體機(jī)理有待進(jìn)一步探究。其次，經(jīng)RFRP-3處理后的SD大鼠附睪在組織形態(tài)上也發(fā)生病理變化，表現(xiàn)為0.1和1.0 μg/d劑量組SD大鼠附睪上皮細(xì)胞發(fā)生變性，甚至出現(xiàn)空泡化，10.0 μg/d劑量組的附睪出現(xiàn)不完整的柱狀上皮。此外，有研究表明RFRP-3能導(dǎo)致雄性小鼠生殖細(xì)胞增殖和存活標(biāo)記物減少，且睪丸中凋亡標(biāo)志物的產(chǎn)生增加（Anjum et al.，2014）。說明RFRP-3促使大鼠附睪退化及精子數(shù)量減少是通過誘導(dǎo)附睪細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)，即RFRP-3對附睪活性具有直接的抑制作用。

本研究結(jié)果表明，RFRP-3能有效提高SD大鼠附睪Caspase-3活性，且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，提示RFRP-3呈劑量依賴性地上調(diào)大鼠附睪細(xì)胞的凋亡水平。Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)呈劑量依賴性下降趨勢，而活性Caspase-3的表達(dá)隨劑量的增加而增加，說明RFRP-3能誘導(dǎo)附睪中的Caspase-3裂解為活性Caspase-3并下調(diào)Bcl-2以觸發(fā)附睪細(xì)胞凋亡。這與Ubuka等（2006）、Anjum等（2014）的研究結(jié)果一致，表明RFRP-3導(dǎo)致雄性哺乳動(dòng)物中的性腺和副生殖器退化與睪丸和附睪細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡和自噬間相互干擾控制，共同決定著細(xì)胞的命運(yùn)。自噬的功能作用一方面可通過增強(qiáng)Caspase-3活性而加速細(xì)胞凋亡，另一方面又能延遲Caspase-3活化作為細(xì)胞延長生命的機(jī)制（Nikoletopoulou et al.，2013;Kasprowska-Li?kiewicz，2017）。本研究結(jié)果顯示，在10.0 μg/d劑量組中RFRP-3處理引起SD大鼠附睪中LC3-II/LC3-I顯著升高且附睪中Beclin-1和Atg5的表達(dá)增加，而在0.1 μg/d劑量組中Beclin-1和Atg5的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，提示不同劑量RFRP-3引起附睪自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果。因此，推測RFRP-3誘導(dǎo)的自噬可增強(qiáng)或抵抗細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

RFRP-3在雄性大鼠附睪中有表達(dá)，但對附睪活性有直接抑制作用，具體作用原理是RFRP-3能誘導(dǎo)附睪中的Caspase-3裂解為活性Caspase-3并下調(diào)Bcl-2表達(dá)以觸發(fā)附睪細(xì)胞凋亡，而附睪細(xì)胞的凋亡促使附睪退化及精子數(shù)量減少。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）