陳金鳳 郭大樂 董自亮 禹奇男 彭濤 李張宇 余佳文 盧慶 姚辰 鄧赟 秦少容

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2957-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.16

摘 要 目的：建立同時測定藿香正氣口服液中9種成分含量的方法，提高并完善藿香正氣口服液質量標準。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法測定10批藿香正氣口服液中甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚9種成分的含量。色譜柱為Kromasil EternityXT-5-C18，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。結果：甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚檢測質量濃度線性范圍分別為0.000 5～0.007 5、0.000 8～0.025 0、0.006 1～0.976 0、 0.001 6～0.250 0、0.007 8～ 0.025 0、0.000 4～0.062 7、0.008 6～0.276 0、0.010 0～0.500 0、0.010 0～0.500 0 mg/mL（r=0.999 2～1.000 0 ）;檢測限分別為0.001 3、0.000 1、0.004 7、0.005 0、0.012 0、0.001 3、0.007 8、0.007 0、0.005 8 μg/mL，定量限分別為0.013 0、0.000 8、0.047 0、0.050 0、0.120 0、0.013 0、0.078 0、0.070 0、0.058 0 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于3.0%（n=6）;平均回收率分別為98.67%、101.85%、98.97%、103.05%、100.00%、97.78%、97.91%、100.13%、101.95%，RSD為1.14%、2.18%、0.40%、0.17%、1.38%、0.85%、1.38%、0.10%、1.35%（n=6）。結論：建立的含量測定方法結果準確、可靠，可為藿香正氣口服液整體質量控制評價體系的建立及質量標準的提高提供依據。

關鍵詞 藿香正氣口服液;HPLC;甘草香豆素;異甘草素;芹糖甘草苷;柚皮蕓香苷;甘草苷;川皮苷;橙皮苷;厚樸酚;和厚樸酚;含量測定

Simultaneous Determination of 9 Components in Huoxiang Zhengqi Oral Liquid by HPLC

CHEN Jinfeng1，GUO Dale1，2，DONG Ziliang2，YU Qinan2，PENG Tao2，LI Zhangyu2，YU Jiawen3，LU Qing3，YAO Chen3，DENG Yun1，QIN Shaorong2，3（1.Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education/State Key Laboratory Breeding of Systematic Research Development and Utilization of Chinese Medical Resources， Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology， College of Pharmacy， Chengdu University of TCM， Chengdu 611137， China;2.Taiji Medical Research Institute， Chongqing ?401147， China;3.Taiji Group Co.， Ltd.， Chongqing ?408000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of nine components in Huoxiang zhengqi oral liquid， and to improve and perfect the quality standard of Huoxiang zhengqi oral liquid. METHODS： The contents of nine components in 10 batches of Huoxiang zhengqi oral liquid were determined by HPLC， such as licorice coumarin， isorlicin， liquiritinapioside， narirutin， liquiritin， saponins， hesperidin， magnolol and honokiol. The determination was performed on Kromasil Eternity XT-5-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 220 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of licorice coumarin， isorlicin， liquiritinapioside， narirutin， liquiritin， saponins， hesperidin， magnolol and honokiolin were 0.000 5-0.007 5， 0.000 8-0.025 0， 0.006 1-0.976 0， 0.001 6-0.250 0， 0.007 8-0.025 0， 0.000 4- 0.062 7， 0.008 6-0.276 0， 0.010 0-0.500 0， 0.010 0-0.500 0 mg/mL （r=0.999 2-1.000 0）. The detection limits were 0.001 3， 0.000 1， 0.004 7， 0.005 0， 0.012 0， 0.001 3， 0.007 8， 0.007 7 0， 0.005 8 μg/mL， and the quantitative limits were 0.013 0， 0.000 8， 0.047 0， 0.050 0， 0.120 0， 0.013 0， 0.078 0， 0.070 0， 0.058 0 μg/mL， respectively; RSD of precision， stability and repeatability tests were less than 3.0% （n=6）. Average recovery rates were 98.67%， 101.85%， 98.97%， 103.05%， 100.00%， 97.78%， 97.91%， 100.13%， 101.95%; RSDs were 1.14%， 2.18%， 0.40%， 0.17%， 1.38%， 0.85%， 1.38%， 0.10%， 1.35% （n=6）. CONCLUSIONS： The established method is accurate and reliable， which can provide reference for the establishment of the overall quality control evaluation system and the improvement of quality standard for Huoxiang zhengqi oral liquid.

KEYWORDS ? Huoxiang zhengqi oral liquid; HPLC; Licorice coumarin; Isorlicin; Liquiritinapioside; Narirutin; Liquiritin; Saponins; Hesperidin; Magnolol; Honokiolin; Content determination

藿香正氣類藥品源于我國宋代官方頒布的方劑藥典《太平惠民合劑局方》中的藿香正氣散，此方以藿香為主藥，配以蒼術、紫蘇葉、甘草、半夏、厚樸、白芷等十味藥[1-2]，具有解表化濕、理氣和中的功效，用于外感風寒、內傷濕滯或夏傷暑濕所致感冒，癥見頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉等癥[3]。在眾多劑型中，藿香正氣口服液具有吸收快、用量準確、體積小、易于服用的優(yōu)點[4]。藿香正氣口服液國內外需求非常大，2018年僅太極集團生產的藿香正氣口服液銷售額已逾15億元（數據源于太極集團內部年度報表）。因此，該藥質量標準的提升不論是在保證藿香正氣口服液的用藥安全、有效和穩(wěn)定方面，還是在響應國家“一帶一路”的號召以促進中醫(yī)藥與國際接軌等方面均有現實意義。

藿香正氣口服液收載于2015年版《中國藥典》（一部），在該標準中采用高效液相色譜（HPLC）方法分別測定橙皮苷、和厚樸酚與厚樸酚的總含量，以其作為質量控制指標[5]。余佳文等[6]建立了同時測定藿香正氣口服液中橙皮苷、柚皮蕓香苷、和厚樸酚、厚樸酚、甘草苷和甘草酸銨含量的超高效液相色譜（UPLC）方法。何丹等[7-8]建立了同時測定藿香正氣口服液中尿苷、鳥苷和腺苷含量的UPLC方法，后期又建立了同時測定藿香正氣口服液中歐前胡素、異歐前胡素含量的UPLC方法。但上述檢測指標均不全面，質量標準有待提高。由于甘草藥材中的黃酮類和香豆素類成分含量較高[9-12]，陳皮藥材中的黃酮類成分含量較高[13-17]，厚樸藥材中木脂素類成分含量較高[18]，所以，其相關單體成分是評價甘草、陳皮和厚樸質量的重要指標，加之多指標成分控制已成為中藥復方制劑質量評價的發(fā)展趨勢，故本研究選取甘草藥材中的黃酮類和香豆素類成分（單體化合物異甘草素、芹糖甘草苷、甘草苷和甘草香豆素）、陳皮藥材中的黃酮類成分（單體化合物柚皮蕓香苷、川皮苷、橙皮苷）、厚樸藥材中的木脂素類成分（單體化合物厚樸酚、和厚樸酚）作為質量評價指標。因此，本課題組建立了同時測定藿香正氣口服液中甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚9種成分含量的HPLC方法，以期對藿香正氣口服液質量標準的提升提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Sartorius BP211D電子天平（德國Sartorius公司）;超純水制造系統（四川優(yōu)普超純科技有限公司）;賽默飛UtiMate 3000 HPLC儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

藿香正氣口服液（太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，批號：17080319、17101817、17060195、18030109、18050149、17050387、1701554、17040117、18050213、17090377，每盒10支裝，每支裝10 mL，以厚樸含厚樸酚與和厚樸酚的總量計不少于0.3 mg/mL，以陳皮含橙皮苷不少于0.1 mg/mL）;甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚對照品（均為本實驗室自制，于同一批次的藿香正氣口服液中分離得到;經鑒定并測定，純度：均大于98%）;陳皮（批號：190200231）、大腹皮飲片（批號：190200281）、茯苓（批號：190501）、厚樸（姜制，批號：190301401）、蒼術（批號：180103161）、干姜各飲片（批號：190302441）均來源于成都康美藥業(yè)生產有限公司，甘草飲片（四川國強中藥飲片有限公司，批號：20181212）;白芷飲片（四川天然生中藥飲片有限公司，批號：181211）、廣藿香油（批號：chb190510，其中百秋李醇含量為27.3%）、紫蘇葉油（批號：190528，其中紫蘇醛含量為40.6%，紫蘇烯含量為20.2%）均來源于成都克洛瑪生物科技有限公司;生半夏（購買自四川省成都市荷花池藥材市場，批號：20190319），以上飲片和藥材均經成都中醫(yī)藥大學藥學院龍飛副教授鑒定為真品;甲醇、乙腈均為色譜純，試驗用水均為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil EternityXT-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）;流速：1 mL/min;檢測波長：220 nm;柱溫：25°C;進樣量：10 ? ? μL。梯度洗脫：0～10 min，8%→18%A;10～15 min，18%→19%A;15～17 min，19%→19%A;17～23 min，19%→20%A;23～27 min，20%→20%A;27～30 min，20%→21%A;30～35 min，21%→21%A;35～38 min，21%→22%A;38～41 min，22%→23%A;41～45 min，23%→26%A;45～51 min，26%→32 A;51～54 min，32%→33%A;54～62 min，33%→55%A;62～72 min，55%→74%A;72～75 min，74%→75%A;75～77 min，75%→77%A;77～80 min，77%→100%A;80～83 min，100%→100%A;83～85 min，100%→8%A。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，加甲醇和水溶解后分別制成質量濃度為0.075 0、0.500 0、0.976 0、0.500 0、0.500 0、0.627 0、0.552 0、0.500 0、0.500 0 mg/mL的對照品貯備液，保存于4 ℃冰箱中備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取批號為17080319的藿香正氣口服液2 mL，減壓干燥為浸膏，精密稱定得0.162 3 g，用甲醇和水稀釋至10 mL，過濾，即得。

2.2.3 缺甘草陰性對照溶液的制備 取蒼術80 g，厚樸（姜制）80 g，陳皮80 g，白芷120 g，茯苓120 g，大腹皮120 g，生半夏80 g，廣藿香油0.8 mL，紫蘇葉油0.4 mL，干姜6.8 g，按照藿香正氣口服液相應工藝制法制成藿香正氣口服液，再按“2.2.2”項下方法制備成缺甘草陰性對照溶液。

2.2.4 缺陳皮陰性對照溶液的制備 取蒼術80 g，厚樸（姜制）80 g，白芷120 g，茯苓120 g，大腹皮120 g，生半夏80 g，甘草浸膏10 g，廣藿香油0.8 mL，紫蘇葉油0.4 mL，干姜6.8 g，按照藿香正氣口服液相應工藝制法制成藿香正氣口服液，再按“2.2.2”項下方法制備成缺陳皮陰性對照溶液。

2.2.5 缺厚樸陰性對照溶液的制備 取蒼術80 g，陳皮80 g，白芷120 g，茯苓120 g，大腹皮120 g，生半夏80 g，甘草浸膏10 g，廣藿香油0.8 mL，紫蘇葉油0.4 mL，干姜6.8 g，按照藿香正氣口服液相應工藝制法制成藿香正氣口服液，再按“2.2.2”項下方法制備成缺厚樸陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別精密量取9種對照品貯備液適量制成混合對照品溶液，再精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和各陰性對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖?？芍?，在“2.1”項色譜條件下，理論板數按厚樸酚峰計不低于5 000，各峰之間及與相鄰峰之間分離度均大于1.5，陰性對照溶液對各成分的測定未見干擾，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下的甘草香豆素對照品貯備液，用30%甲醇依次稀釋得每1 mL含甘草香豆素0.007 5、0.003 7、0.001 9、0.000 9、0.000 6、0.000 5 mg的6組不同質量濃度的對照品溶液;以同樣的方法，得到每1 mL含0.025 0、0. 012 5、0.006 3、0.003 1、0.001 6、0.000 8 mg的6組不同質量濃度的異甘草素對照品溶液，每1 mL含0.976 0、0.097 6、0.048 8、0.024 4、0.012 2、0.006 1 mg的6組不同質量濃度的芹糖甘草苷對照品溶液，每1 mL含0.250 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5、0.006 3、0.001 6 mg的6組不同質量濃度的柚皮蕓香苷對照品溶液，每1 mL含0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 mg的 6組不同質量濃度的甘草苷對照品溶液，每1 mL含0.062 7、0.006 3、0.003 1、0.001 6、0.000 7、0.000 4 mg的6組不同質量濃度的川皮苷對照品溶液，每1 mL含0.276 0、0.138 0、0.069 0、0.034 5、0.017 3、0.008 6 mg的6組不同質量濃度的橙皮苷對照品溶液，每1 mL含0.500 0、0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5、0.010 0 mg的6組不同質量濃度的厚樸酚對照品溶液，每1 mL含0.500 0、0.100 0、0.050 0、0.025 0、0.012 5、0.010 0 mg的6組不同質量濃度的和厚樸酚對照品溶液;按“2.1”項下條件進樣測定。以對照品的質量濃度（mg/mL）為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，得到各成分的線性關系結果見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

精密稱取甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚適量，加甲醇和水溶解后制成0.013 0、0.008 0、0.047 0、0.050 0、0.120 0、0.013 0、0.078 0、0.070 0、0.058 0 mg/mL的混合對照品溶液，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，當信噪比為3 ∶ 1時得檢測限;當信噪比為10 ∶ 1時得定量限。結果，甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚檢測限分別為0.001 3、0.000 1、0.004 7、0.005 0、0.012 0、0.001 3、0.007 8、0.007 0、0.005 8 μg/mL，定量限分別為0.013 0、0.000 8、0.047 0、0.050 0、0.120 0、0.013 0、0.078 0、0.070 0、0.058 0 μg/mL。

2.6 精密度試驗

分別精密量取9種對照品貯備液適量制成混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.06%、0.17%、1.43%、1.24%、0.23%、0.15%、0.53%、0.27%、0.97%（n=6），9種成分峰面積的RSD值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取批號為17080319樣品，制備成供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為1.92%、0.09%、0.51%、1.43%、0.85%、0.45%、0.56%、0.56%、0.51%（n=6），9種成分峰面積的RSD值均小于2%，表明供試品溶液于室溫下放置24 h內基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取批號為17080319的口服液，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD值分別為2.88%、0.53%、0.56%、0.40%、0.36%、1.81%、0.43%、1.81%、2.23%（n=6），9種成分峰面積的RSD值均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取批號為17080319的藿香正氣口服液6份，每份2 mL，分別加入一定質量濃度的單一對照品溶液各適量，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

按“2.2.2”項下方法處理10批樣品，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚的含量，結果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取混合對照品溶液在192～798 nm的波長范圍內進行檢測，結果表明在220 nm波長下各目標成分峰形、分離度較好，檢測強度適中，故選擇220 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

前期試驗對甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸水等不同組成的流動相進行了考察。結果顯示，以乙腈-0.05%磷酸水為流動相進行梯度洗脫時分離效果較好，基線平穩(wěn)、洗脫能力強，出峰穩(wěn)定且峰形尖銳，故選擇乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。

3.3 測定成分的選擇

針對藿香正氣口服液化學成分復雜的客觀事實，本試驗建立了同時測定藿香正氣口服液中甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚9種成分含量的HPLC方法。查閱文獻，本試驗是第一次對藿香正氣口服液中的甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、川皮苷4種成分進行含量測定，本試驗結果可為更好地建立藿香正氣口服液整體質量控制評價體系提供科學試驗依據。

在選取的測定成分中，甘草苷和芹糖甘草苷均是甘草中黃酮類成分的代表性成分[19]，甘草中黃酮類成分具有鎮(zhèn)咳作用，而甘草苷和芹糖甘草苷是其中最重要的鎮(zhèn)咳成分;異甘草素是從甘草根的水解產物中分解出來的一種黃酮類成分，具有抗病毒、抗炎、抗血管生成等多種生物活性，并且其抗腫瘤作用是近年來研究的熱點[12];甘草香豆素是甘草中具有代表性的一種香豆素類化合物，具有防治原發(fā)性肝癌的藥理活性作用[20];橙皮苷和柚皮蕓香苷是陳皮中具有代表性的黃酮類化合物，具有抗炎、調節(jié)免疫等藥理活性[14，21-23];川皮苷是陳皮中的一種多甲基黃酮類化合物，具有多種生物活性，其抗癌和抗炎作用尤為突出[17];厚樸酚與和厚樸是厚樸中具有代表性的木脂素類化合物，具有抗腹瀉的作用[24]。

綜上所述，本研究建立了同時測定藿香正氣口服液中甘草香豆素、異甘草素、芹糖甘草苷、柚皮蕓香苷、甘草苷、川皮苷、橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚9種成分的含量的HPLC方法，該方法準確、可靠，可為提高藿香正氣口服液整體質量的控制標準提供參考。

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（收稿日期：2019-06-17 修回日期：2019-07-26）

（編輯：劉 萍）