李克勤，朱文成，曲永蘊，劉 慇，趙海軍，李廣強，季延平*

﹙1.萊州市文峰路街道農(nóng)業(yè)綜合服務站，山東 萊州261431；2.山東省林業(yè)科學研究院森林保護研究所，山東 濟南 250014；3.菏澤市牡丹區(qū)牡丹研究所，山東 菏澤 274000；4.棗莊市三農(nóng)服務中心，山東 棗莊 277000﹚

根結線蟲（Meloidogyne）世界性分布，可以侵染果樹、蔬菜、糧食作物、經(jīng)濟作物以及觀賞植物等3000多種植物，造成嚴重的經(jīng)濟損失，是一類重要的植物病原[1]。油用牡丹是我國獨有植物，原生物種，品種主要為“鳳丹”和“紫斑”，出油率30%以上，其中α-亞麻酸含量達42.34%[2]。但是，隨著油用牡丹栽培面積的迅速擴展，油用牡丹病害的發(fā)生危害呈上升的趨勢[3]。由于根結線蟲的危害，油用牡丹籽產(chǎn)量和品質(zhì)已經(jīng)受到嚴重影響，對當?shù)亟?jīng)濟造成沉重打擊。針對油用牡丹根結線蟲病的防治，主要以高毒、高殘留的化學殺線蟲劑為主，長期使用污染土壤和水體，破壞生態(tài)環(huán)境，嚴重威脅人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，近年來，國內(nèi)外研究人員一直關注尋找殺線活性穩(wěn)定并能夠大規(guī)模生產(chǎn)開發(fā)的微生物來防治根結線蟲[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，捕食線蟲真菌[7,8]、內(nèi)寄生線蟲真菌[9]、機會真菌[10,11]、產(chǎn)毒真菌[12]等食線蟲真菌，寄生細菌[13,14]以及放線菌[9]等微生物具有殺線活性，可以用于線蟲生物防治，控制其危害。

本文在油用牡丹根結線蟲高效拮抗微生物篩選中，分離獲得1株高效殺線細菌HZ087，測定了其發(fā)酵液對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲、卵的殺滅效果，驗證其生防潛力，并采用形態(tài)學特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，對HZ087菌株進行鑒定，以期為油用牡丹根結線蟲病的生物防治提供新的生防資源。

1 材料和方法

1.1 菌株分離

在山東省林科院試驗苗圃、壽光蔬菜大棚、菏澤市牡丹田，采集根際土壤樣品。采用稀釋分離法，稱取5g樣品，將樣品放入有50mL無菌水和有玻璃球的三角瓶中振蕩15min，將上清液依次稀釋，10-2-10-7，取100μL 10-5-10-7上清液均勻涂布于NA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，72h后將單菌落接種到NA培養(yǎng)基上，4℃保存、備用。

1.2 供試根結線蟲的繁殖與準備

從感病的油用牡丹根部收集根結線蟲新鮮卵塊，1%NaClO溶液表面消毒，無菌水沖洗3次，置于25℃恒溫箱中。待孵化后收集幼蟲，配制根結線蟲液（100條/mL），4℃保存、備用。

1.3 殺線活性菌株的篩選

將分離獲得的細菌 25℃、200rpm振蕩培養(yǎng)48h，分別吸取1mL發(fā)酵液和0.5 mL線蟲液加入到滅菌的培養(yǎng)皿中，混合均勻，置25℃下培養(yǎng)48h，以不接菌的液體培養(yǎng)基為空白對照。每個處理重復3次。在培養(yǎng)皿中加入2滴0.05%亞甲基藍溶液，10min鏡檢，蟲體藍色表示死亡，活蟲不著色的表示正常[15]。分別統(tǒng)計死亡線蟲數(shù)和總蟲數(shù)，計算線蟲死亡率。

1.4 HZ087菌株發(fā)酵液對油用牡丹根結線蟲2齡幼蟲的毒殺效果測定

將HZ087菌株發(fā)酵液稀釋成5倍、10倍等2個梯度，測定方法同1.3。

1.5 HZ087菌株發(fā)酵液對油用牡丹根結線蟲卵的毒殺效果測定

將被根結線蟲侵染的油用牡丹根剪碎后置于三角瓶中，加入100mL 0.5%的NaClO溶液，振蕩2min，快速倒入200-500目篩組中，自來水沖洗10min，收集500目篩網(wǎng)中的卵，稀釋成3000粒／mL的卵懸浮液。毒殺效果測定采用室內(nèi)離體培養(yǎng)法。在培養(yǎng)皿中加入2mL根結線蟲卵懸浮液，再加入相應的HZ087發(fā)酵液，配置成2倍、5倍、10倍等3個梯度，清水作對照，重復 3次，分別在 4d、6d、8d和10d觀察卵的孵化情況。

1.6 菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)學鑒定

將菌株進行菌體形態(tài)染色，觀察培養(yǎng)性狀、生理生化指標測定。

1.6.2 分子生物學鑒定

采用細菌DNA提取試劑盒提取菌株DNA。菌株16S rRNA基因片段PCR擴增及序列測定。引物： 所用引物細菌通用引物 B27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3′）；1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海派森諾生物科技有限公司合成。

PCR反應體系：50 μL反應體系，包括：2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 ×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 5 μL，模板 DNA 1 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，雙蒸水 32.5 μL。PCR 擴增條件：94 °C 預變性 5 min；94 °C 變性 0.5min，52 °C 退火 0.5min，72 °C 1 min，30 個循環(huán)；72 °C 10 min[16]。

將獲得序列在 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中進行比對，選取12株Bacillus sp.菌株，以Streptomyce albofaciens JCM 4342作為外圍菌株。利用MGEA 7.0中的Clustal W對各基因序列進行比對，然后利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法（Bootstrap）進行檢測，共循環(huán)1000次。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件，差異顯著性分析采用Duncan氏多重比較法。

2 結果與分析

2.1 殺線菌株篩選

由表1可知，室內(nèi)測定的561株菌株中，有217株菌株在一定程度上表現(xiàn)出殺傷油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲的能力。用濃度為109cfu/mL的菌懸液處理幼蟲48h，校正死亡率在90%以上有1株菌株，占0.46%；校正死亡率在80%-90%有6株菌株，占1.97%；校正死亡率在70%-80%的有26株菌株，占11.98%。

表1 處理48h油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲室內(nèi)校正死亡率在70%以上的菌株

2.2 HZ087發(fā)酵液對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲的抑制作用

從表2可以看出，處理 12h、24h、36h和 48h后，隨著處理時間的增加，HZ087發(fā)酵液對2齡幼蟲的抑制作用越來越強，而清水對照組的抑制率基本不變。處理相同時間內(nèi)，不同發(fā)酵液濃度對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲的抑制作用不同，稀釋5倍液的抑制效果顯著高于稀釋10倍液和清水對照。在處理后48h，發(fā)酵液稀釋5倍液的校正死亡率達到90.83%。

表2 HZ087對油用牡丹根結線蟲二齡幼蟲活力的抑制作用

2.3 HZ087發(fā)酵液對油用牡丹根結線蟲卵孵化率的影響

從表3可以看出，HZ087發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)處理后，油用牡丹根結線蟲卵的孵化率不同。稀釋倍數(shù)越高，卵的孵化率越高，稀釋倍數(shù)與卵的孵化率成正比。同一稀釋倍數(shù)，隨著處理時間的增加，卵的孵化率增加。HZ087菌懸液2倍稀釋液處理后的第4d，根結線蟲卵的孵化率最低，7.27%，抑制效果隨著稀釋倍數(shù)增高成遞減。HZ087發(fā)酵液稀釋10倍處理第10d，根結線蟲卵的孵化率為64.77%，僅低于清水處理。

表3 HZ087發(fā)酵液處理后油用牡丹根結線蟲卵的孵化率

2.4 菌株鑒定

2.4.1 HZ087菌株形態(tài)特征

HZ087菌株革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，桿狀、長為6.2～12.1μm，寬0.9～1.5μm。在NA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)48h后，菌落平展、乳白色、圓形，表面不規(guī)則，中間有圓環(huán)形突起，邊緣不整齊，不產(chǎn)色素。在NB液體培養(yǎng)，棕黃色，渾濁，有沉淀，形成菌膜。

2.4.2 HZ087菌株生理生化特性

NaCl濃度在2%～10%之間HZ087菌株生長性狀一致。氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗弱陽性，能利用檸檬酸鹽，能產(chǎn)生尿素酶分解尿素，不產(chǎn)H2S，VP試驗陽性，能利用苦杏仁苷、ZT，具體見表4。

表4 HZ087菌株的生理生化特性

2.4.3 HZ087菌株基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析

將HZ087菌株的16SrDNA擴增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，與Bacillus amyloliquefaciens同源性為99%。采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖1可知，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，標尺指示0.02步變化，節(jié)點處為自展率，分支長度和為0.4422。HZ087菌株與B.amyloliquefaciens JC-07、B.amyloliquefaciens S2QPS31菌株聚在一個分支上，自展率為99%，表明HZ087菌株為B.amyloliq uefaciens，結合HZ087菌株的形態(tài)特征、生理生化特性，鑒定HZ087菌株為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

圖1 利用鄰接法（NJ）基于HZ087菌株16SrDNA基因數(shù)據(jù)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。自展支持率標注于節(jié)點處，標尺指示0.02步變化。

3 結論與討論

根結線蟲的生防因子有真菌、細菌、病毒和原生動物等，由于細菌易培養(yǎng)、繁殖速度快，后期易加工等特點，生防細菌在根結線蟲生物防治研究中占有重要地位。目前研究比較多的有巴氏桿菌、假單胞菌、蘇云金桿菌、堅強芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[13,14,17-20]。本研究從土壤中分離獲得1株對油用牡丹根結線蟲具有較強殺線活性的細菌菌株HZ087，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。1943年Fukumoto首次發(fā)現(xiàn)了解淀粉芽孢桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens），1987年 Priest確立為一個單獨的種。解淀粉芽孢桿菌在自然界廣泛存在，可以用來防治植物真菌病害、細菌病害、線蟲、植物病毒等，具有開發(fā)成生物農(nóng)藥的潛力，應用前景廣闊，是一類重要的優(yōu)良的生防微生物資源。室內(nèi)測定發(fā)現(xiàn)，HZ087發(fā)酵液不僅對油用牡丹根結線蟲2齡幼蟲具有較強的抑制作用，而且可以抑制卵的孵化。拮抗細菌可以產(chǎn)生殺毒物質(zhì)直接殺死線蟲、通過占據(jù)營養(yǎng)和空間位點來抑制根結線蟲，也可以在“細菌-寄主-根結線蟲”系統(tǒng)中，通過分泌物質(zhì)改變寄主根系分泌物，避免線蟲危害寄主植物。本研究獲得解淀粉芽孢桿菌HZ087菌株對油用牡丹根結線蟲的作用機理還需要進一步研究。

本試驗只是在離體條件下測定抑制效果，田間土壤中微生物種類繁多，土壤環(huán)境復雜，HZ087菌株能否有效定殖、防治效果還有待進一步研究。