沈 飛，黃 怡，周曰春，劉 琴，裴 斐，李 彭，方 勇，劉興泉

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京靈山糧食儲(chǔ)備庫有限公司，江蘇 南京 211599；3.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

玉米是世界三大糧食作物之一，但由于玉米原始水分高、胚部大、吸濕性強(qiáng)、脂肪含量高，使其不耐儲(chǔ)藏，在儲(chǔ)運(yùn)期間易受黑曲霉、白曲霉等有害霉菌侵染而發(fā)生霉變，從而降低玉米品質(zhì)，甚至產(chǎn)生嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素，嚴(yán)重威脅人畜健康[1-2]。因此，如果在玉米儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和加工過程中，能夠快速檢測(cè)出霉變玉米，可以有效剔除霉變產(chǎn)品，避免受污染的玉米作為飼料或者糧食原料進(jìn)入消費(fèi)環(huán)節(jié)，從而維護(hù)人畜身心健康。目前，玉米霉菌侵染的檢測(cè)方法主要有干片培養(yǎng)法[3]、酶聯(lián)免疫吸附法[4-5]和熒光檢測(cè)法[6-7]等。但這些檢測(cè)手段普遍存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長、成本高等問題，不能滿足玉米收購、儲(chǔ)運(yùn)和交易時(shí)快速檢測(cè)要求。近年來，近紅外光譜和機(jī)器視覺技術(shù)作為快速無損技術(shù)，已廣泛用于水果[8-10]、肉類[11-13]等各類食品的檢測(cè)中，在糧食品質(zhì)[14-16]、毒素[17-19]檢測(cè)等方面也開展了一些應(yīng)用。在玉米分析方面，Chu Xuan等[20]利用傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)對(duì)150 個(gè)玉米籽粒進(jìn)行了檢測(cè)，根據(jù)霉變程度（無癥狀、中度霉變和重度霉變），采用線性判別分析（liner discriminant analysis，LDA）建立模型，校準(zhǔn)和驗(yàn)證集的分類精度分別達(dá)91.4%和86.7%。Tallada等[21]利用近紅外反射光譜和彩色成像對(duì)受8 種不同真菌侵染玉米籽粒進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)侵染水平進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)近紅外（near infrared，NIR）光譜對(duì)不同霉變程度樣品的判別準(zhǔn)確率為89%；而彩色成像能區(qū)分75%的未侵染和侵染玉米籽粒。然而，目前絕大多數(shù)研究仍停留在靜態(tài)檢測(cè)階段，在線檢測(cè)方面亟待進(jìn)一步深入。此外，近紅外光譜技術(shù)無法有效獲取被測(cè)樣品的外部信息，且容易受外界光、濕度等的噪音干擾，影響檢測(cè)精度。圖像處理檢測(cè)技術(shù)能通過提取顏色、紋理等外部參數(shù)來鑒定是否霉變，但不能準(zhǔn)確檢驗(yàn)內(nèi)部損傷、輕微病害感染等內(nèi)部缺陷。因此，將兩種技術(shù)融合可以同時(shí)獲得樣品的內(nèi)外部信息，能夠更全面評(píng)估樣品品質(zhì)，從而提高方法的可信度。

因此，本研究擬以感染不同種類有害霉菌的玉米樣品為研究對(duì)象，在線獲取不同儲(chǔ)藏階段（0、6、9、12 d和15 d）玉米樣品的可見-近紅外光譜和圖像信息，并將提取的玉米樣品光譜特征波長和圖像特征顏色參數(shù)進(jìn)行融合，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段建立玉米霉變程度的在線識(shí)別方法，并定量預(yù)測(cè)玉米的菌落總數(shù)水平，以探索可見-近紅外光譜和圖像數(shù)據(jù)融合技術(shù)用于有害霉菌侵染玉米在線檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

2017年新收獲玉米樣品（蘇玉20），經(jīng)南京航空航天大學(xué)輻照中心Co-60輻照（劑量：12 kGy）滅菌后裝入無菌塑料密封袋，4 ℃冷藏，備用。

5 種玉米中常見有害霉菌：白曲霉（Aspergillus candidus）182448、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）195647、黑曲霉（A. niger）186380、寄生曲霉（A. parasiticus）3.3950和赭曲霉（A. ochraceus）3.3486，均購于中國北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

MCS 600型可見-近紅外光譜儀、OMK500-H/NIR漫反射探頭 德國Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 霉菌孢子懸浮液制備

將5 種有害霉菌分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，置于28 ℃和85%相對(duì)濕度（relative humidity，RH）培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待霉菌生長產(chǎn)生大量孢子，用無菌水沖洗培養(yǎng)基的表面菌絲，收集孢子懸浮液于100 mL錐形瓶中，依據(jù)GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的平板計(jì)數(shù)法[22]分別統(tǒng)計(jì)5 種霉菌孢子懸浮液濃度，并用無菌水調(diào)節(jié)懸浮液孢子濃度至約1×105CFU/mL，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 玉米樣品霉菌接種

稱取每份約100 g的滅菌玉米樣品共270 份，隨機(jī)分成6 組，每組45 份。玉米霉菌接種步驟為：在室溫20 ℃條件下，將玉米樣品放置于上方有開孔的滅菌塑料盒（規(guī)格：115 mm×115 mm×65 mm）中，用移液槍精確移取1 mL霉菌孢子菌液均勻接種于樣品上并充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｃ糠N霉菌各接種45 個(gè)樣品，5 種霉菌共計(jì)接種225 份樣品。剩余45 份樣品加入1 mL的無菌水作為空白對(duì)照組。以上操作均在無菌環(huán)境下操作，接種完畢后轉(zhuǎn)移至6 個(gè)不同的人工氣候箱（28 ℃和85% RH）中儲(chǔ)藏15 d以加速霉變。樣品從接種霉菌起，選取儲(chǔ)藏時(shí)間節(jié)點(diǎn)0、6、9、12 d和15 d，從對(duì)照組和每種霉菌侵染玉米樣品中各隨機(jī)選取9 份，每次共計(jì)45 份樣品，樣品分析前均放于4 ℃冷藏。

1.3.3 玉米樣品可見-近紅外光譜和圖像在線采集

圖1 可見-近紅外光譜圖像在線檢測(cè)系統(tǒng)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of visible/near infrared spectroscopy and image online detection system

圖1 為可見-近紅外光譜和圖像在線檢測(cè)系統(tǒng)示意圖，該系統(tǒng)主要由可見-近紅外光纖光譜儀、漫反射探頭、數(shù)字相機(jī)、LED環(huán)形光源、遮光箱、傳送帶和電動(dòng)機(jī)等部分構(gòu)成。光譜采集步驟如下：將冷藏的樣品置于室溫下2 h直至樣品達(dá)到室溫。可見-近紅外光譜儀預(yù)熱30 min。將玉米樣品放置于直徑90 mm培養(yǎng)皿中并平整，將培養(yǎng)皿放置于可調(diào)速皮帶傳送帶中線位置處，傳送帶速率為0.15 m/s。當(dāng)樣品傳送至與光譜儀連接的OMK500-H/NIR漫反射探頭正下方時(shí)采集樣品光譜，采集波長范圍為560～1 700 nm，積分時(shí)間20 ms；每個(gè)樣品重復(fù)裝樣掃描3 次，取平均光譜進(jìn)行分析。圖像采集步驟如下：將采集完光譜的樣品培養(yǎng)皿放置于傳送帶（鋪黑色不反光攝影布作為背景）中線位置處，傳送帶速率為0.15 m/s；當(dāng)樣品傳送至MV-EM120C/M型相機(jī)（陜西維視圖像公司）正下方時(shí)拍攝樣品圖像，分辨率為1 280×960像素，圖片以JPEG格式存儲(chǔ)。光譜圖像采集完畢后，對(duì)所用樣品參照國標(biāo)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行玉米菌落總數(shù)的測(cè)定，將所得結(jié)果取對(duì)數(shù)，以用于后續(xù)建模分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與模型構(gòu)建

采用MATLAB 2015a軟件（美國Mathworks公司）對(duì)光譜和圖像進(jìn)行處理和建模。首先，運(yùn)用平滑和多元散射校正等方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理[23]，并運(yùn)用正自適應(yīng)加權(quán)算法提取光譜特征波長用于后續(xù)模型計(jì)算[24]。正自適應(yīng)加權(quán)算法是通過自適應(yīng)重加權(quán)采樣技術(shù)選擇出PLS模型中回歸系數(shù)絕對(duì)值大的波長點(diǎn)，去掉權(quán)重小的波長點(diǎn)，利用交互驗(yàn)證選出交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean squared error of cross validation，RMSECV）最低的子集，可有效獲得最優(yōu)變量組合（特征波長）。運(yùn)用灰度化、二值化處理、形態(tài)學(xué)運(yùn)算、邊緣檢測(cè)等，對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，去除黑色背景部分的無用信息，并提取圖像的RGB顏色特征參數(shù)（紅色、綠色、藍(lán)色）和HIS（色調(diào)、飽和度、亮度）顏色模型中的各顏色分量均值和方差作為樣品的圖像特征參數(shù)[25]。最后將提取的光譜特征波長和圖像特征顏色參數(shù)融合成玉米樣品的總特征參數(shù)。其次，運(yùn)用主成分分析（principal component analysis，PCA）分析不同霉變程度樣品的聚類趨勢(shì)；再通過LDA建立不同霉變程度玉米的定性判別模型[26]。最后進(jìn)行偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析[27]時(shí)，將光譜特征波長、圖像顏色特征參數(shù)及光譜和圖像融合特征參數(shù)為自變量，菌落總數(shù)作為因變量進(jìn)行建模。評(píng)估PLSR模型性能的指標(biāo)有：模型決定系數(shù)（correlation coefficient of determination，R2）、建模均方根誤差（root mean squared error of calibration，RMSEC）和預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean squared error of calibration and prediction，RMSEP）、RMSECV和相對(duì)分析偏差（residual predictive deviation，RPD）等，其中RPD為預(yù)測(cè)集標(biāo)準(zhǔn)偏差與RMSEP的比值[28]。模型建立時(shí)，隨機(jī)選取2/3的樣品用于模型構(gòu)建，剩余1/3樣品用于模型性能驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米菌落總數(shù)與霉變程度分析

圖2 不同儲(chǔ)藏階段玉米樣品菌落總數(shù)的變化Fig. 2 Colony counts of control maize samples and samples infected with 5 different fungal species during storage

參考前人研究，根據(jù)菌落總數(shù)高低可將玉米樣品分為未霉變（＜3.0（lg（CFU/g）））、霉變（3.0～7.0（lg（CFU/g）））和嚴(yán)重霉變（＞7.0（lg（CFU/g）））3 類[29]。如圖2所示，接種不同霉菌樣品的霉菌菌落總數(shù)快速遞增，表明樣品霉變程度逐漸加深。不同霉菌的增長速率總體差異不大，以黑曲霉186380繁殖速率最快，寄生曲霉3.3950相對(duì)滯后。除寄生曲霉3.3950外其他接種樣品第12天均已達(dá)到嚴(yán)重霉變，而寄生曲霉3.3950樣品第15天才達(dá)到嚴(yán)重霉變。而未接種霉菌的對(duì)照組樣品雖然經(jīng)過輻照滅菌處理，但無法做到與周圍環(huán)境的完全隔離，其霉菌總數(shù)也緩慢增長，第9天時(shí)樣品仍處于未霉變狀態(tài)；到第12天時(shí)開始處于霉變狀態(tài)（3.43（lg（CFU/g））），但仍顯著低于同一儲(chǔ)藏階段其他接種霉菌的樣品。綜上，盡管不同霉菌的繁殖速率存在差異，但菌落總數(shù)整體呈顯著上升趨勢(shì)，表明樣品中霉菌整體的新陳代謝活動(dòng)旺盛，產(chǎn)生大量次級(jí)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致玉米化學(xué)組成不斷發(fā)生變化，同時(shí)樣品表面也出現(xiàn)霉變區(qū)域，為基于光譜和圖像信息的霉變分析提供了可能。

2.2 玉米可見-近紅外光譜分析

圖3 儲(chǔ)藏第12天時(shí)感染不同霉菌及未接種霉菌玉米（a）和感染寄生曲霉3.3950玉米在不同儲(chǔ)藏階段（b）的原始平均光譜圖Fig. 3 Average raw spectra of maize samples inoculated or not inoculated with various fungi after storage for 12 days (a) and average raw spectra of maize samples contaminated with A. parasiticus 3.3950 strain at different storage times (b)

圖3 a為儲(chǔ)藏第12天時(shí)未接種霉菌和感染不同霉菌玉米樣品的平均可見-近紅外光譜圖，其他儲(chǔ)藏階段的光譜特征與之類似。感染不同霉菌的樣品光譜在600～1 600 nm波長范圍內(nèi)整體相似，存在許多典型的共有光譜，主要吸收峰位于962、1 143 nm和1 411 nm波長處，分別對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)、氨基酸和淀粉中N—H和C—H基團(tuán)的二級(jí)振動(dòng)、水中O—H基團(tuán)的一級(jí)基頻振動(dòng)等[30]。在600～1 200 nm范圍內(nèi)，接種不同霉菌樣品的光譜吸光度普遍高于未接種樣品的吸光度。在1 200～1 600 nm范圍內(nèi)，除層出鐮刀菌組樣品外，接種其他霉菌樣品的光譜吸光度均低于未接種樣品的吸光度。圖3b為受寄生曲霉3.3950侵染的玉米樣品在不同儲(chǔ)藏階段的平均光譜圖。感染其他霉菌樣品的光譜差異與之類似，故未列出。觀察可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，玉米樣品的吸光度在962、1 143 nm和1 411 nm等波長處主要吸收峰處呈遞減趨勢(shì)。結(jié)果表明，隨著霉變程度的加深，霉菌侵染引起的玉米物理和化學(xué)變化越來越顯著，從而玉米光譜呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化。

2.3 玉米圖像信息分析

圖4 不同儲(chǔ)藏階段感染不同霉菌及未接種霉菌玉米樣品原始圖像Fig. 4 Original images of maize samples inoculated or not inoculated with various fungi at different storage times

由圖4可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，接種霉菌的玉米樣品表面顏色發(fā)生明顯變化，受不同霉菌侵染的樣品的圖像特征隨著儲(chǔ)藏階段的進(jìn)行差異也越來越顯著。第0天感染不同霉菌和未接種霉菌玉米表面均鮮艷有光澤，第9天接種不同霉菌玉米樣品表面發(fā)生了明顯的顏色暗淡、光澤度降低等變化，第12天開始接種霉菌的樣品已經(jīng)嚴(yán)重霉變，樣品幾乎都被菌絲覆蓋，接種寄生曲霉3.3950樣品霉變程度低于接種其他4 種霉菌的樣品，表面霉變區(qū)域較少。第15天所有接種霉菌樣品均已達(dá)到嚴(yán)重霉變。

2.4 PCA結(jié)果

分別利用光譜特征波長、圖像特征顏色參數(shù)及光譜和圖像融合特征參數(shù)，未接種和接種不同霉菌玉米樣品不同霉變程度（未霉變、霉變和嚴(yán)重霉變）的主成分得分如圖5所示。所運(yùn)用的光譜和圖像特征數(shù)如表1所示。2 個(gè)主成分貢獻(xiàn)之和在80.71%～93.75%之間，盡管不同霉變程度樣品在得分圖上的分布區(qū)域有部分重疊，但整體上仍存在一定聚類趨勢(shì)。結(jié)果表明，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長，霉菌繁殖和代謝導(dǎo)致玉米樣品的光譜和圖像產(chǎn)生了系統(tǒng)性變化，為進(jìn)一步的判別分析提供了基礎(chǔ)。利用光譜特征波長及利用光譜和圖像融合特征參數(shù)的聚類趨勢(shì)略低于單獨(dú)利用圖像特征顏色參數(shù)效果。未霉變和霉變樣品重疊較多，這可能是由于第12、15天時(shí)未接種樣品霉變程度較低，與接種霉菌樣品出現(xiàn)部分重疊。

圖5 未接種和感染不同霉菌的小麥樣品隨霉變程度的主成分得分圖Fig. 5 PCA score plots of control and infected maize samples in terms of mildew degree

2.5 不同霉變程度（儲(chǔ)藏階段）玉米樣品LDA結(jié)果

將玉米樣品依據(jù)霉變程度劃分為3 類（未霉變、霉變和嚴(yán)重霉變），分別運(yùn)用光譜特征波長、圖像特征顏色參數(shù)及光譜和圖像融合信息建立不同霉變程度玉米樣品的LDA模型見表1，LDA模型能較好區(qū)分不同霉變程度單一霉菌侵染樣品，基于光譜特征波長對(duì)不同霉變程度樣品的建模集準(zhǔn)確率均為100%，預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率均在86.7%以上?；趫D像特征顏色參數(shù)對(duì)不同霉變程度樣品的建模集準(zhǔn)確率除對(duì)照組（96.7%）外均為100%，預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率均在86.7%以上。其中對(duì)照組樣品霉變程度不明顯導(dǎo)致樣品顏色無較大改變，從而判別準(zhǔn)確率較低?；诠庾V和圖像融合特征參數(shù)對(duì)不同霉變程度樣品的建模集和預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率均為100%。當(dāng)然，受單一霉菌侵染的模型樣本集還較為有限（建模集30 個(gè)樣品，預(yù)測(cè)集15 個(gè)樣品），還需要進(jìn)一步補(bǔ)充樣品數(shù)量提高模型的穩(wěn)健性。進(jìn)一步，當(dāng)對(duì)未接種和接種不同霉菌的全部270 個(gè)樣品進(jìn)行綜合建模時(shí)，基于光譜和圖像融合信息的模型同樣取得了較優(yōu)的效果，建模集和預(yù)測(cè)集準(zhǔn)確率分別為98.3%和91.1%，比單獨(dú)應(yīng)用光譜和圖像時(shí)的準(zhǔn)確率分別提高4.4%和8.9%。結(jié)果說明，隨著儲(chǔ)藏過程的進(jìn)行，樣品霉變程度加深，可見-近紅外光譜融合圖像可有效獲取樣品的內(nèi)部和外部整體差異信息，在區(qū)分樣品霉變程度時(shí)展現(xiàn)更高的精度優(yōu)勢(shì)。

表1 不同霉變程度玉米樣品LDA模型判別結(jié)果Table 1 LDA discrimination results of maize samples with different mildew degrees

2.6 玉米樣品霉菌菌落總數(shù)PLSR定量預(yù)測(cè)

PLSR建模方法分別以光譜特征波長吸光度、圖像顏色特征參數(shù)及光譜和圖像融合特征參數(shù)為自變量，玉米樣品菌落總數(shù)為因變量，選取2/3樣品作為建模集，剩余1/3樣品作為驗(yàn)證預(yù)測(cè)集，其定量分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。值、RPD值越大和RMSEP值越小模型性能較優(yōu)[31]。由表2可知，基于光譜特征波長吸光度、圖像顏色特征參數(shù)和光譜及圖像融合信息對(duì)受單一霉菌侵染的玉米樣品進(jìn)行建模和預(yù)測(cè)時(shí)，分別高于0.920和0.890，RMSEC低于0.522（lg（CFU/g）），RMSEP值也較小（0.313～0.728（lg（CFU/g）））。對(duì)單一霉菌進(jìn)行交互驗(yàn)證時(shí)，所得RMSECV值也偏低，均小于1.109（lg（CFU/g））。除基于光譜特征波長的層出鐮刀菌195647組外，其余各組模型的RPD值均大于3.0，表明模型具有定量分析應(yīng)用潛力。對(duì)所有霉菌侵染的225 份玉米樣品和27 份菌落總數(shù)不為0的對(duì)照組樣品綜合建立PLSR分析模型，共252 個(gè)樣品參與建模。結(jié)果表明，3 個(gè)模型的預(yù)測(cè)集的值分別為0.851、0.889和0.894，RMSEP分別為0.823、0.717、0.665（lg（CFU/g）），RPD值分別為2.46、2.93和3.06。從結(jié)果可以看出，基于光譜及圖像融合特征參數(shù)建立的PLSR模型效果普遍優(yōu)于單一光譜和圖像技術(shù)建立的模型效果，表明該模型魯棒性較好，預(yù)測(cè)精度高，可用于定量分析。圖6為基于光譜特征波長吸光度、圖像顏色特征參數(shù)和光譜特征波長及圖像特征參數(shù)融合信息的所有252 個(gè)玉米樣品菌落總數(shù)實(shí)測(cè)值與光譜預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系圖，樣品均分布于中心線兩側(cè)，表明兩者具有較高的相關(guān)性。由于樣品來源的差異性，模型性能略有下降，但RPD值仍較高，表明模型具有一定的實(shí)際檢測(cè)能力。

表2 玉米中霉菌總數(shù)PLSR模型預(yù)測(cè)分析結(jié)果Table 2 Predicted results of colony forming units in maize samples by PLSR model

圖6 玉米樣品中菌落總數(shù)與光譜特征波長（a）、圖像特征顏色參數(shù)（b）和光譜和圖像融合特征參數(shù)（c）預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系Fig. 6 Correlation between actual colony counts in maize samples and predictions from characteristic wavelengths (a), image color feature parameters (b) and data fusion (c)

3 結(jié) 論

可見-近紅外光譜可在線獲取不同霉變程度玉米樣品內(nèi)部有機(jī)分子的基頻振動(dòng)信息，而機(jī)器視覺技術(shù)可實(shí)時(shí)獲得樣品外部的可見光圖像信息，兩類信息具有不同的來源和屬性。本研究的結(jié)果表明，PCA、LDA和PLSR等多元統(tǒng)計(jì)方法可以有效融合樣品的光譜和圖像信息，實(shí)現(xiàn)其內(nèi)部與外部信息的綜合利用，從而提升在線檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。當(dāng)然，本研究僅實(shí)現(xiàn)了樣品信息的在線采集，將來還需要在檢測(cè)軟件開發(fā)、模型嵌入和模型調(diào)用等方面進(jìn)一步研究，以實(shí)現(xiàn)真正的在線檢測(cè)。另一方面，還需要不斷補(bǔ)充更多受不同霉菌侵染的玉米樣品，以增強(qiáng)模型的穩(wěn)健性和方法適用性。