房 芳，張九凱，馬雪婷，蘇 敏，陳 穎,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.烏魯木齊海關(guān)，新疆 烏魯木齊 830063）

阿膠是一種由哺乳綱奇蹄目馬科動(dòng)物驢的皮為主要原料熬制而成的膠類藥材[1]，具有補(bǔ)血滋陰、潤(rùn)燥止血、增強(qiáng)人體免疫力等功效[2-4]，與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”[5]。由于驢皮原料不足，價(jià)格昂貴，一些不法商人受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，在阿膠生產(chǎn)過(guò)程中摻入低價(jià)膠類藥材，如新阿膠（豬皮源）、黃明膠（牛皮源），非法謀利的情況屢見不鮮[6]，除此以外，使用其他性狀相似的哺乳動(dòng)物皮類（如馬皮）投料違法生產(chǎn)的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生[7]，致使市場(chǎng)上阿膠藥材摻假、摻雜現(xiàn)象嚴(yán)重，市場(chǎng)秩序混亂。

傳統(tǒng)的物種鑒別技術(shù)主要以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[8]和以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)方法[9-13]為主。基于蛋白水平的ELISA技術(shù)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，可同時(shí)檢測(cè)大量樣品，但是該方法一次只能檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)，不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種，反映特異性也不好，假陽(yáng)性較高[14]。核酸檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，是動(dòng)物源性產(chǎn)品物種鑒別的主流方法[15-17]，但由于阿膠為深度加工產(chǎn)品，在長(zhǎng)時(shí)間高溫熬煮過(guò)程中，DNA破壞嚴(yán)重[18]，限制了核酸技術(shù)在阿膠摻假物物種鑒別的應(yīng)用。阿膠中的主要成分是驢皮膠原蛋白高溫不完全水解后的肽段，從分子遺傳學(xué)角度研究，由于不同物種DNA序列不同，其表達(dá)的氨基酸序列必然存在差異，使得不同來(lái)源蛋白酶切生成的肽段具有一定的特異性。利用靈敏度高、重復(fù)性好的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同物種間特征肽進(jìn)行分析和測(cè)定[19-22]，為阿膠的物種鑒別提供了新的途徑。

近年來(lái)，以質(zhì)譜為核心技術(shù)的鳥槍蛋白組學(xué)方法在物種鑒別領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，該技術(shù)將蛋白質(zhì)混合物酶解成肽段混合物，并利用色譜及質(zhì)譜對(duì)具有物種特異性的特征肽段進(jìn)行分析、鑒定，從而達(dá)到物種鑒別的目的[23-26]。與傳統(tǒng)方法相比，肽段穩(wěn)定性更高，受生產(chǎn)加工方式的影響也相對(duì)較小。因此，本研究針對(duì)阿膠中摻入低價(jià)膠類藥材，如新阿膠（豬皮膠）、黃明膠（牛皮膠）和近緣膠（馬皮膠）的現(xiàn)象，采用鳥槍蛋白組學(xué)方法，通過(guò)比對(duì)驢和豬、牛、馬的蛋白酶解后的肽段序列，以期從肽段層面實(shí)現(xiàn)阿膠中異源性物種來(lái)源的鑒定，并為其他動(dòng)物源性食品或藥材的物種鑒定提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠（n=3）、黃明膠（n=3）、新阿膠（n=2）、馬皮膠（按藥用阿膠工藝制得，n=2）、生驢皮（n=2）、生牛皮（n=2）、生豬皮（n=2）、生馬皮（n=2）北京同仁堂公司；阿膠對(duì)照藥材 中國(guó)食品藥品檢定研究院；96孔板 美國(guó)Thermo公司；濾紙 美國(guó)Whatman公司。

乙腈（色譜級(jí)） 德國(guó)CNW公司；甲酸 美國(guó)Sigma公司；去離子水 Milli-Q純水系統(tǒng)；胰蛋白酶美國(guó)Thermo Fisher-Pierce公司；尿素（蛋白質(zhì)組學(xué)級(jí)）美國(guó)Promega公司；硫脲 美國(guó)Americo公司；考馬斯亮藍(lán)G250 北京克爾慧公司；牛血清蛋白 美國(guó)Sigma公司；碳酸氫鈉（純度99%） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)。

蛋白質(zhì)提取液：含有7 mol/mL尿素和2 mol/mL硫脲。稱取210.2 g尿素，76.12 g硫脲在常溫下用去離子水溶解并定容至500 mL（溶液溫度控制在37 ℃以下）。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.01 g牛血清蛋白置于10 mL容量瓶中，用 0.15 mol/L NaCl溶液定容至10 mL，室溫下充分混合溶解1 h，10 000 r/min離心。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD XR高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；TripleTOF?5600質(zhì)譜儀、QTRAP?5500質(zhì)譜儀美國(guó)AB SCIEX公司；Chrom XP Eksigent C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 nm）、Multiskan GO型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；BEH C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm，300 nm） 美國(guó)Waters公司；TissueLyser II型組織研磨儀 德國(guó)QIAGEN公司；ME403E型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Concentrator plus型真空濃縮儀、Centrifuge 5418R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SB5200D型超聲清洗儀寧波新芝生物科技股份有限公司；Vortex-Genie 2型振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市白塔新寶儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取與含量測(cè)定

取約2 g樣品制成粉末，稱取0.50 g皮膠粉末，加入5 mL蛋白提取液，離心后測(cè)定上清液中蛋白含量，取約含200 μg蛋白的上清液并轉(zhuǎn)移到超濾管中，12 000 r/min離心10 min，加入100 μL 50 mmol/mL碳酸氫銨溶液，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，加入100 μL含有胰蛋白酶的50 mmol/mL碳酸氫銨溶液振蕩混勻，37 ℃酶解4 h（膠原蛋白因不含半胱氨酸而未涉及烷基化處理）。將下層超濾離心管取下放入冷凍干燥機(jī)中旋干濾液，加入去離子水，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，最后加入100 μL 2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液定容。

Bradford法測(cè)定蛋白含量：1）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：分別移取0、20、40、50、60、80、100 μL 1 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL EP管中，加入相應(yīng)體積尿素-硫脲液補(bǔ)足100 μL。配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度：0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg/mL。2）樣品溶液稀釋：分別將樣品上清液稀釋合適倍數(shù)，混勻備用。3）分別取各系列濃度溶液及樣品稀釋液30 μL，加入1 mL考馬斯亮藍(lán)染料，混合均勻。4）分別取300 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品稀釋液的混合液加入96 孔板樣品孔中，595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定樣品，計(jì)算相應(yīng)蛋白含量。

1.3.2 檢測(cè)條件

1.3.2.1 納升高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（nano high performance liquid chromatography-quadrupoles time of fl ight-mass spectrometer，Nano-HPLC-QTOF-MS）條件

在線Nano-HPLC條件：色譜柱：Chrom XP Eksigent C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm）；上樣流速2 μL/min；時(shí)間10 min；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液；流動(dòng)相B為98%乙腈（含0.1%甲酸）溶液；流速0.3 μL/min；進(jìn)樣體積4 μL；梯度洗脫程序：0～0.1 min，5%～9% B；0.1～30 min，9%～25% B；30～40 min，25%～35% B；40～45 min，35%～80% B；45～50 min，80% B；50～51 min，5% B；51～60 min，5% B。

AB SCIEX Triple TOF?5600 QTOF-MS條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式；噴霧電壓：2.4 kV；霧化氣：41.4 kPa；氣簾氣：207 kPa；質(zhì)譜掃描模式：信息依賴型采集工作模式；TOF MS模式：m/z350～1 500，250 ms；IDA TOF MS/MS模式：m/z100～1 500，30 MS/MS，100 ms，IDA閾值：120 cps，母離子電荷選擇范圍為＋2～＋5；Rolling CE：enabled；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間：20 s；運(yùn)行時(shí)間：60 min。

1.3.2.2 高效液相色譜和三重四極桿質(zhì)譜條件

高效液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），流動(dòng)相A為2%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，流動(dòng)相B為98%乙腈（含0.1%甲酸）溶液，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～0.1 min，2% B；0.1～0.5 min，2%～8% B；0.5～25 min，8%～22% B；25～31 min，22%～35% B；31～33 min，35%～80% B；33～36 min，80% B；36～36.5 min，80%～2% B；36.5～39.9 min，2% B。

AB QTRAP?5500質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描參數(shù)：氣簾氣（CUR）2.76×105Pa，碰撞氣（CAD）Medium，IS電壓5 500 V，離子源溫度600 ℃，霧化器（GAS1）414 kPa，輔助氣（GAS2）414 kPa；正離子掃描Scheduled多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式：MRM檢測(cè)窗口60 s；掃描時(shí)間3 s。

1.3.3 特征肽段的檢測(cè)與驗(yàn)證鑒定

以奇蹄目（Perissodactyla）、偶蹄目（Artiodactyla）為關(guān)鍵詞，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)并導(dǎo)入ProteinPilot 5.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定，參數(shù)設(shè)定如下：Sample Type：Identification；Cys Alkylation：Iodoacetic acid；Digestion：Trypsin；Search Effort：Rapid ID；ID Focus：Biological modifications；FASTA：Sesamum indicum（Uniprot）。選取響應(yīng)高、得分＞20、氨基酸個(gè)數(shù)6～20、可信度＞95%、無(wú)漏切的肽段作為預(yù)選特征肽段。

利用Skyline軟件構(gòu)建馬皮特征肽MRM離子對(duì)，將特征肽段轉(zhuǎn)化為三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜能夠識(shí)別的離子對(duì)信息。同時(shí)對(duì)離子對(duì)的碰撞能量和駐留時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠及摻假膠蛋白鑒定

通過(guò)Nano-HPLC-QTOF-MS分別對(duì)阿膠、新阿膠、黃明膠和馬皮膠樣品進(jìn)行鑒定，并采用ProteinPilot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理（表1）。結(jié)果顯示，阿膠、新阿膠和黃明膠鑒定到豐度最高、有效肽段總數(shù)最多的蛋白分別為驢源、豬源、牛源的I型膠原蛋白α1鏈，而馬皮膠豐度最高的蛋白為驢源I型膠原蛋白α1鏈，說(shuō)明驢和馬的膠原蛋白有很強(qiáng)的親緣性，此外在馬皮膠的鑒定結(jié)果中并沒有找到與馬源I型膠原蛋白α1鏈具有較高的匹配度的蛋白。I型膠原蛋白是動(dòng)物源性皮類膠原蛋白重要組成，約占膠原蛋白總量的80%～90%，陸生哺乳動(dòng)物I型膠原蛋白主要分為α1、α2兩種亞型[27]。除膠原蛋白以外，還鑒定到核層蛋白、肌球蛋白、角蛋白、血影蛋白等，僅在阿膠樣品中檢測(cè)到血紅蛋白。

表1 高分辨質(zhì)譜鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Results of identi fi cation of donkey-hide gelatin and animal glues by high-resolution mass spectrometry

2.2 不同物種來(lái)源膠類特征肽段檢測(cè)結(jié)果

由于阿膠、新阿膠、黃明膠樣品溶液鑒定到豐度最高的蛋白分別為驢源、豬源、牛源的I型膠原蛋白α1鏈，且馬皮膠豐度最高的蛋白也為驢源I型膠原蛋白α1鏈。因此，利用GENtle軟件對(duì)驢、豬、牛的I型α1膠原蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)模擬胰蛋白酶酶切分別獲得3 種膠原蛋白的理論特征肽段。采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀MRM方法對(duì)3 種膠原蛋白的理論特征肽進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了4 條理論特征肽的存在，受試的驢皮膠（含阿膠對(duì)照藥材）及生驢皮、新阿膠及生豬皮、黃明膠及生牛皮的酶解溶液中均驗(yàn)證到各自物種的特征肽段，而不同物種樣品間各特征肽互不檢出。馬皮膠、生馬皮的酶解溶液中驗(yàn)證到驢的特征肽段（表2）。

表2 特異肽段的MRM參數(shù)Table 2 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters for specific peptides

2.3 驢、豬和牛來(lái)源膠類特征肽段檢測(cè)結(jié)果

圖1 3 個(gè)物種膠原蛋白COL I型α1序列差異比對(duì)Fig. 1 Sequence alignment of collagen I α1 in 3 species

圖2 3 個(gè)物種膠原蛋白COLI型α1序列三螺旋域與非三螺旋域Fig. 2 Triple helix domain and non-triple helix domain of collagen I α1 sequence in 3 species

3 個(gè)物種膠原蛋白C O L I型α1序列差異比對(duì)見圖1。在證實(shí)的4 條特征肽中，阿膠特征肽1066GEAGPAGPAGPIGPVGAR1083、新阿膠特征肽1069GETGPAGPAGPVGPVGAR1086和黃明膠特征肽1066GETGPAGPAGPIGPVGAR1083具有很強(qiáng)的相似性：1）3 條肽段所在序列位置相近，前12 個(gè)氨基酸殘基位于序列中的非三螺旋結(jié)構(gòu)域，其余6 個(gè)則位于最后一段三螺旋結(jié)構(gòu)域的起始位置（圖2）；2）3 條肽段均由18 個(gè)氨基酸組成，氨基酸排列順序極為相似，僅有2 處氨基酸殘基存在差異；3）序列中氨基酸均未發(fā)生修飾。由于三螺旋結(jié)構(gòu)是膠原蛋白的特有結(jié)構(gòu)，膠原蛋白所特有的羥脯氨酸是膠原三螺旋結(jié)構(gòu)形成氫鍵的必需氨基酸，由此推斷，在膠原蛋白非螺旋域附近更容易獲得未經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸序列。

由于在驢、豬、牛的I型膠原蛋白α1序列相似位置都驗(yàn)證到具有物種專屬性的特征肽，因此通過(guò)考察不同動(dòng)物模擬酶切后的I型膠原蛋白α1序列，發(fā)現(xiàn)很多動(dòng)物在此相似序列位置均可找到符合上述規(guī)律且適合三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定的差異肽段。這一發(fā)現(xiàn)得到相關(guān)文獻(xiàn)印證，驢、馬同屬馬科，親緣性強(qiáng)，GEAGPAGPAGPIGPVGAR[28]為驢和馬共有特征肽；GETGPAGPAGPIGPVGAR[28]為牛（哺乳綱，偶蹄目，?？疲伲┑奶卣麟亩?，GETGPAGPAGPVGPVGAR[28]為豬（哺乳綱，偶蹄目，豬科，豬屬）的特征肽段，GETGPAGPAGPPGPAGAR[29]為雞（哺乳綱，雞形目，雉科，原雞屬）特征肽段，GESGPAGPAGAMGPAGPR[30]為魚（軟骨魚綱、硬骨魚綱）特征肽段。因此初步推斷，分屬不同科或更高生物分類級(jí)別的動(dòng)物在此序列位置容易找到差異肽段，這一點(diǎn)為今后探索膠原蛋白物種差異性及相關(guān)食品、藥品真?zhèn)舞b別方法的建立提供了啟發(fā)和思路。

模擬胰蛋白酶酶切3 條特征肽所在的非螺旋域序列，選取長(zhǎng)度適合三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析的肽段，利用MRM方法對(duì)酶切肽段進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明有個(gè)別肽段在酶切后沒有驗(yàn)證到（表3），因此推斷此區(qū)域肽鏈很可能在加工過(guò)程中就已發(fā)生斷裂。肽段①和肽段⑩在制膠后仍然能驗(yàn)證到（驢、豬、牛膠原蛋白的肽段⑩位置均為各自的特征肽），這說(shuō)明非酶切斷裂處雖然靠近螺旋域的兩端，但并不是發(fā)生在三螺旋域和非三螺旋結(jié)構(gòu)交界處，而是位于交界處向非三螺旋域延伸約10～25 個(gè)氨基酸殘基處，非螺旋區(qū)域中段的肽段基本保持完整（圖3）。大部分蛋白質(zhì)中脯氨酸含量極低，而膠原蛋白中含有大量脯氨酸和羥脯氨酸，這兩種氨基酸都是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此膠原蛋白具有微彈性和很強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度。以上研究表明，膠原蛋白肽鏈具有一定的拉伸強(qiáng)度，在高溫加工過(guò)程中非螺旋域序列不會(huì)完全斷裂，大部分肽段具有較好的熱穩(wěn)定性。

表3 制膠過(guò)程中非三螺旋域源肽段裂解情況Table 3 Cleavage of non-triple helix domain peptides during industrial processing of donkey-hide gelatin

圖3 制膠過(guò)程中非三螺旋域裂解位點(diǎn)的比較分析Fig. 3 Comparison of non-triple helix domain cleavage sites during industrial processing of donkey-hide gelatin

2.4 馬皮膠特征肽的檢測(cè)結(jié)果

由于驢和馬同為馬科（Equidae）馬屬（Equidae），膠原蛋白親緣性太強(qiáng)，因此馬皮膠、生馬皮的膠原蛋白的酶切溶液中可驗(yàn)證到驢的特征肽GEAGPAGPAGPIGPVGAR。利用Nano-UPLC-QTOFMS鑒定結(jié)果尋找馬皮膠的特征肽，采用ProteinPilot軟件搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中物種蛋白序列信息，在置信度99%條件下，獲得了2 條來(lái)自馬源特征肽，其中一條LSVEADIN*GLR（*表示脫酰胺修飾）來(lái)源于馬源角蛋白。角蛋白是構(gòu)成表皮、毛皮及毛囊的主要蛋白質(zhì)，由此可以分析得知這條肽段是由于皮類原料中殘留的毛發(fā)或毛囊所帶入的。但由于這條肽段豐度不高，在實(shí)際應(yīng)用中需要對(duì)樣品進(jìn)行一定程度的濃縮處理。毛發(fā)和毛囊在生皮原料中很難完全去除，因此，從角蛋白角度尋找不同物種間的差異肽段實(shí)現(xiàn)溯源具備理論可行性。另一條馬的專屬特征肽ISGEWYSIFLASDVK，數(shù)據(jù)庫(kù)信息尚不完全，目前肽段所屬蛋白和源基因都未經(jīng)命名，有待進(jìn)一步研究。2 條肽段經(jīng)過(guò)深加工過(guò)程仍能檢測(cè)到，說(shuō)明特征肽段穩(wěn)定性良好，適合作為馬皮特征肽。

表4 馬皮膠特征肽段的MRM參數(shù)Table 4 MRM parameters for speci fi c peptides from horse-hide gelatin

利用Skyline軟件構(gòu)建馬皮特征肽MRM方法離子對(duì)，通過(guò)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，在生馬皮酶解溶液、馬皮膠酶解溶液中均檢測(cè)到馬皮特征肽離子，進(jìn)一步證實(shí)了馬皮特征肽的存在，且這2 條特征肽在阿膠、新阿膠、黃明膠樣品中均未發(fā)現(xiàn)，即證明此2 條肽段為馬皮膠的專屬特征肽段。馬皮膠特征肽二級(jí)質(zhì)譜圖見圖4，驢、馬、牛、豬皮源特征肽段XIC圖見圖5。

圖4 Nano-HPLC-QTOF-MS對(duì)馬皮膠特征肽的鑒定結(jié)果Fig. 4 Identification of specific peptides from horse-hide gelatin by Nano-HPLC-QTOF-MS

圖5 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)特征肽的鑒定結(jié)果Fig. 5 Identification of marker peptides by tandem mass spectrometry

3 結(jié) 論

針對(duì)阿膠中摻入新阿膠（豬皮膠）、黃明膠（牛皮膠）等低價(jià)膠類藥材以及阿膠原料皮混雜馬皮的現(xiàn)象，本研究從肽段層面解決阿膠中異源性物種的鑒別問(wèn)題。首先利用鳥槍蛋白組學(xué)技術(shù)在I型膠原蛋白中分別檢測(cè)到驢、牛和豬的特征肽段共4 條，可用于鑒別阿膠中摻入的新阿膠及黃明膠。其次在馬源角蛋白和未命名蛋白中獲得了2 條馬皮特征肽段，可用于鑒別阿膠驢皮原料中混雜的馬皮。同時(shí)，制膠過(guò)程中I型膠原蛋白的裂解規(guī)律以及膠原蛋白源物種特異肽段的序列特征的發(fā)現(xiàn)，不僅為從事阿膠異源性物種鑒別的科研人員提供了理論參考，還可以為其他動(dòng)物源性食品或藥材的物種鑒定提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。