吳 振，李 紅，楊 勇,3，譚紅軍，詹 永,*，賈鳳霞，李孝彬，王福強(qiáng)

（1.重慶市中藥研究院，中藥健康學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121；3.重慶市中藥大健康工程技術(shù)研究中心，重慶 400065；4.四川省廣元市旺蒼縣農(nóng)業(yè)局，四川 廣元 628200）

花椒屬（Zanthoxylum）植物屬蕓香科灌木，小喬木或木質(zhì)藤本，全世界約有250 種，我國(guó)約有39 種和14 變種；主要包括紅花椒（Z. bungeanum Maxim.）和青花椒（Z. schinifolium Sieb. et Zucc.）[1-3]?；ń穼僦参锏母?、枝、葉、果皮均具有食用和藥用功效，其中花椒果皮（以下統(tǒng)稱花椒）可作為調(diào)味品、香辛料、木本油料或入藥，以其良好的生理活性受到人們的廣泛關(guān)注和研究[4-8]?；ń窢I(yíng)養(yǎng)成分豐富，主要有揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿（主要為喹啉類和異喹啉類）、鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類（即麻味物質(zhì)）、不飽和脂肪酸、花椒香豆素、芳樟醇、乙酸芳樟酯、D-檸檬烯等[9-15]；研究表明，花椒提取物具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛、減肥、降血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[16-18]。

花椒所含無機(jī)元素的研究也備受關(guān)注，不同產(chǎn)地和品種花椒中活性成分差異較大，無機(jī)元素含量不僅受花椒遺傳特性的控制，而且與不同栽培地區(qū)的環(huán)境因素及栽培條件等因素有關(guān)[10]。研究和分析花椒無機(jī)元素的種類及其含量，對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)健康和攝入安全有至關(guān)重要的作用，有利于評(píng)價(jià)花椒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，了解其被污染的情況和程度，以便查清和控制污染源[19]；同時(shí)探尋能表征花椒地域信息的特異性指標(biāo)，有利于產(chǎn)地保護(hù)和溯源。無機(jī)元素的含量差異能反映花椒的品質(zhì)及其產(chǎn)地特征，結(jié)合數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析比較，對(duì)花椒品質(zhì)評(píng)價(jià)、產(chǎn)地判別和“產(chǎn)品確證”具有重要意義。紅花椒主要產(chǎn)地為陜西韓城、山東泰安、四川漢源、茂汶和會(huì)陽、甘肅武都、河北涉縣等，青花椒主產(chǎn)地云南昭通、貴州關(guān)嶺、四川金陽、四川漢源、重慶江津等，不同地區(qū)的氣候、水質(zhì)、種植條件、施肥方法以及土壤類型均存在較大差異。目前，無機(jī)元素分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水果、蜂蜜、茶葉、葡萄酒產(chǎn)地溯源的研究與應(yīng)用[20-25]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（inductively coupled plasmaatomic emission spectrometry，ICP-AES）法測(cè)定不同產(chǎn)地和品種花椒中Al、B、Ba、Ca、Cd、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Pb、As、Se、Hg、Cr、V、Sr 21 種無機(jī)元素的含量，對(duì)國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)地的紅花椒和青花椒資源的無機(jī)元素組成數(shù)據(jù)應(yīng)用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLSDA），為花椒資源的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)、污染狀況、產(chǎn)地識(shí)別與保護(hù)、創(chuàng)新與利用等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試花椒材料為全國(guó)6 個(gè)省份搜集的花椒種質(zhì)80 份。紅花椒產(chǎn)地：陜西韓城（n=11）、四川漢源（n=7）、四川茂汶（n=7）、甘肅武都（n=7）。青花椒主產(chǎn)地：云南昭通（n=11）、貴州關(guān)嶺（n=8）、四川金陽（n=10）、四川漢源（n=8）、重慶江津（n=11）。

Al、B、Ba、Ca、Cd、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Pb、As、Se、Hg、Cr、V和Sr標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 mg/L） 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；硝酸、過氧化氫均為優(yōu)級(jí)純，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所用溶液均利用蒸餾水自行配制；所用玻璃器皿均用1%硝酸浸泡24 h，以便除去雜質(zhì)等因素干擾，然后用去離子水沖洗2～3 次，烘干備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Optima 7000DV型全譜直讀ICP-AES儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒濕法消化

花椒樣品采集后去除雜質(zhì)，置陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干，再置于50 ℃干燥箱中烘干至恒定質(zhì)量，粉碎后過60 目篩，置于干燥器中備用。將樣品（5.00 g）置于潔凈的250 mL玻璃圓底燒瓶，加入一定量的HNO3-HClO4（4∶1，V/V）混酸加熱消化完全，注意及時(shí)補(bǔ)加混酸，當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時(shí)，繼續(xù)加熱至近干，再向三角瓶中加入少量超純水繼續(xù)加熱以去除多余的高氯酸，蒸發(fā)至近干，冷至室溫，加濃HNO310 mL及適量水溶解消化產(chǎn)物并定容于50 mL容量瓶中成為供試液。每個(gè)樣品分別濕法消解3 次，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.3.2 ICP-AES測(cè)定條件

參考姚鑫等[26]的方法。儀器參數(shù)：射頻功率1 350 W；檢測(cè)器CID低波段（＜265 nm），積分時(shí)間15 s；高波段（＞265 nm），積分時(shí)間5 s；進(jìn)樣霧化器氬氣壓力28 psi；進(jìn)樣蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速100 r/min；輔助氣流量1.0 L/min，載氣流速1.12 L/min；測(cè)定波長(zhǎng)范圍188.979～396.153 nm。

1.3.3 花椒無機(jī)元素的測(cè)定

按1.3.2節(jié)所述ICP-MS儀器工作條件，測(cè)定質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素含量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。然后按1.3.1節(jié)方法消解花椒樣品，測(cè)定、計(jì)算樣品中各無機(jī)元素含量。

1.3.4 PCA和PLS-DA方法

由于花椒各元素指標(biāo)在量綱和數(shù)量級(jí)上存在較大差異，為降低量綱和數(shù)量級(jí)對(duì)分析結(jié)果的影響偏差，PCA和PLS-DA均采用經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)化公式如下：

式中：Xij為第i單位的第j指標(biāo)值經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)；Yij為第i單位的第j指標(biāo)值；j和Sj分別為第j指標(biāo)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

顯著性分析采用SAS 8.2（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）的最小顯著性差異法，P＜0.05，差異顯著。采用SIMCA-P 13.0（Umetrics，Umea，Sweden）進(jìn)行PCA和PLS-DA多變量數(shù)據(jù)組的相似性或相異性，分別測(cè)定3 次，根據(jù)不同產(chǎn)地與無機(jī)元素相關(guān)數(shù)據(jù)矩陣計(jì)算其特征值和貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度、重復(fù)性和加樣回收率結(jié)果

各無機(jī)元素的精密度、重復(fù)性分別在0.48%～2.36%和1.25%～3.01%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.87%～3.45%之間，加樣回收率在95.7%～106.3%之間，說明該方法良好。

2.2 花椒中21 種無機(jī)元素含量的測(cè)定分析

如表1所示，比較不同產(chǎn)地花椒中無機(jī)元素的含量，發(fā)現(xiàn)Al、Ca、Na、K、Fe、Mg、Mn等元素含量較高，其平均值分別達(dá)到154.72、297.85、323.23、814.43、25.41、363.48、38.92 μg/g，其中Al、Ca、Na、K、Fe、Mg、Mn平均含量最高的產(chǎn)地分別為：陜西韓城、四川漢源（青花椒）、重慶江津、陜西韓城、貴州關(guān)嶺、陜西韓城、重慶江津。測(cè)定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地花椒的常量元素、微量元素和重金屬差異較大。Cd、Pb、As、Hg、Cr等重金屬均未超過GB 2762—2017《食品中污染物限量》中關(guān)于香辛料的限量要求。盡管如此，但各個(gè)產(chǎn)地重金屬差異仍然較大，針對(duì)目前不同產(chǎn)地花椒質(zhì)量及污染狀態(tài)復(fù)雜情況，分析不同產(chǎn)地花椒共性主因子作為質(zhì)量控制指標(biāo)，也可有效控制不同產(chǎn)地花椒的污染狀況。

表1 不同產(chǎn)地花椒中無機(jī)元素含量（n=3）Table 1 Concentrations of inorganic elements in Zanthoxylum from different geographical origins (n= 3)μg/g

表2 不同產(chǎn)地花椒中無機(jī)元素的相關(guān)性矩陣Table 2 Correlation matrix of inorganic elements of Zanthoxylum from different geographical origins

2.3 花椒無機(jī)元素含量相關(guān)性分析

采用SAS 8.2軟件進(jìn)行花椒各無機(jī)元素間相關(guān)性分析，如表2所示。顯著性分析發(fā)現(xiàn)，花椒中有諸多對(duì)元素呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），如Ca與Fe、Se、Sr呈正相關(guān)，Cu與Al、Ba、Co、Na、Pb、As、Cr、V呈正相關(guān)，F(xiàn)e與Sr呈極顯著正相關(guān)，表明這些元素間具有相互協(xié)同、促進(jìn)吸收的關(guān)系，同時(shí)說明花椒在富集以上無機(jī)元素時(shí)具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，但其差異與花椒品種、栽培環(huán)境等因素相關(guān)；負(fù)相關(guān)表明該對(duì)元素間具有相互拮抗的關(guān)系，如Ca與Cd、Co、Cu、Ni、Pb、Cr、V等之間；Hg與其他元素相關(guān)性較差，說明Hg元素差異可能主要源于環(huán)境土壤差異。此外，不同產(chǎn)地花椒的無機(jī)元素存在較大差異，可能與產(chǎn)地的土壤、氣候等因素相關(guān)，同時(shí)花椒品種及個(gè)體差異對(duì)無機(jī)元素的吸收和富集能力也不盡相同，但在花椒的生長(zhǎng)過程中這些元素之間是如何相互影響的仍有待進(jìn)一步研究。

2.4 PCA和PLS-DA分析花椒中21 種無機(jī)元素

2.4.1 主成分及主因子提取過程分析

表3 PCA和PLS-DA的累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 3 Accumulated contribution rate of PCA and PLS-DA

如表3所示，根據(jù)特征值大于1的原則[27]，PCA主要提取了5 個(gè)主成分，其特征值分別為8.738、4.956、2.661、1.304、1.008，各個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為41.60%、23.60%、12.67%、6.21%、4.80%，累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)88.88%；PLS-DA提取了6 個(gè)主因子，其特征值分別為134.034、57.759、16.178、3.298、2.083、1.456，各個(gè)主因子的方差貢獻(xiàn)率分別為62.10%、26.76%、7.50%、1.53%、0.97%、0.68%，累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)99.54%；其中PCA和PLS-DA的前3 個(gè)主成分和主因子分別反映了原始數(shù)據(jù)提供信息總量的77.87%和96.36%。因此可以將PLS-DA的前3 個(gè)主因子作為評(píng)價(jià)所采集的80 份花椒樣品質(zhì)量的綜合變量，達(dá)到了對(duì)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地花椒無機(jī)元素含量指標(biāo)的降維目的。

提取了PCA初始因子載荷矩陣，根據(jù)各無機(jī)元素在前3 個(gè)主要主成分上的載荷，可確定Al、B、Cd、Cu、Mn、Ni、Se、Cr為花椒的特征元素。

2.4.2 基于PCA和PLS-DA的花椒產(chǎn)地及其品種的分類分析

經(jīng)PCA和PLS-DA得到各花椒樣品的PC1、PC2和PC3得分值（或主因子得分值），分別以PC1為X軸、PC2為Y軸（或以PC1為X軸、PC3為Y軸），將80 個(gè)花椒樣品點(diǎn)分別標(biāo)入二維坐標(biāo)系中，即得到各主成分（或主因子）得分的二維圖，見圖1。由圖1A可知，PC1-PC2散點(diǎn)圖可得到樣品的分類，80 個(gè)不同產(chǎn)地的花椒聚為9 類，以PC1-PC2為指標(biāo)的分類結(jié)果與采樣數(shù)據(jù)的分類結(jié)果基本一致；盡管如此，以PC1-PC3散點(diǎn)圖未能將花椒樣品有效區(qū)分（圖1B）。由圖1C、D可知，PLS-DA的散點(diǎn)圖均可將80 個(gè)不同產(chǎn)地的花椒聚為9 類；PLS-DA模型表明：紅花椒品種均聚于散點(diǎn)圖的右側(cè)，而青花椒品種均聚于左側(cè)。因此，花椒無機(jī)元素含量結(jié)合PLS-DA模型分析可以有效的將不同產(chǎn)地和品種的花椒樣品區(qū)分。研究無機(jī)元素對(duì)花椒品種和產(chǎn)地的影響，為花椒的品種選擇、生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

圖1 基于PCA（A、B）和PLS-DA（C、D）的不同產(chǎn)地花椒樣品分布散點(diǎn)圖Fig. 1 Scattering plots of PCA (A, B) and PLS-DA (C, D) for geographical origins of Zanthoxylum

圖2 PCA（A）和PLS-DA（B）的花椒無機(jī)元素載荷圖Fig. 2 Loading plots of PCA (A) and PLS-DA (B) for inorganic elements of Zanthoxylum

如圖2所示，原始變量點(diǎn)在單個(gè)向量上的投影，與對(duì)應(yīng)變量在主成分或主因子上的差異量相關(guān)，余弦值為負(fù)時(shí)，向量負(fù)相關(guān)；余弦值的絕對(duì)值大小反映兩向量間的相關(guān)性大小，值越大表明2 個(gè)向量對(duì)應(yīng)的屬性之間相關(guān)性越高[28]。圖2中各花椒無機(jī)元素向量長(zhǎng)短（即分別在主成分或主因子的載荷）代表其能解釋原始變量的程度（即差異貢獻(xiàn)），其方向表示與主成分（或主因子）的相關(guān)性；圖2中2 個(gè)不同花椒無機(jī)元素向量夾角小于90°代表其呈正相關(guān)；當(dāng)2 個(gè)向量近似垂直時(shí)，2 個(gè)屬性之間相關(guān)性很弱，幾乎互不影響；不同花椒無機(jī)元素向量方向相反代表其間存在負(fù)相關(guān)；如圖2B所示，Ni和B向量幾乎重合（之間夾角較?。?，表明其存在很強(qiáng)的相關(guān)性，這與表2的分析一致。王帥等[29]研究了九葉青花椒葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素主要物候期動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為花椒樹體的營(yíng)養(yǎng)診斷和科學(xué)施肥提供依據(jù)；鄭雅楠[30]研究發(fā)現(xiàn)，Al、Fe、V、K、Zn、Pb為陜西花椒的特征元素，但對(duì)無機(jī)元素聚類分析不能區(qū)分花椒的產(chǎn)區(qū)；國(guó)內(nèi)外研究均認(rèn)為決定植物性資源元素含量和分布特征的根本因素是其產(chǎn)地環(huán)境和品種[31-33]。PCA與PLS-DA均為經(jīng)典的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，通過數(shù)學(xué)多維模型進(jìn)行降維和排除干擾處理，從而直觀地發(fā)現(xiàn)花椒無機(jī)元素組別之間的差異。通過結(jié)合并對(duì)比花椒無機(jī)元素的PCA與PLS-DA模型，可以篩選花椒的特征元素，揭示產(chǎn)地環(huán)境和品種對(duì)花椒品質(zhì)和產(chǎn)地保護(hù)的影響，并建立花椒資源的產(chǎn)地與品種的判別和質(zhì)量評(píng)價(jià)模型。

3 結(jié) 論

采用ICP-AES可以有效分析花椒中21 個(gè)無機(jī)元素（Al、B、Ba、Ca、Cd、Co、Cu、Na、K、Fe、Mg、Mn、Zn、Ni、Pb、As、Se、Hg、Cr、V、Sr），可評(píng)價(jià)各產(chǎn)地紅花椒和青花椒的元素含量、污染狀態(tài)及其綜合品質(zhì)。所構(gòu)建的花椒整體無機(jī)元素的指紋圖譜及其PLS-DA方法，克服了由單個(gè)或幾個(gè)成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)研究花椒產(chǎn)地及其品質(zhì)的缺陷。本研究通過PCA和PLS-DA進(jìn)行花椒產(chǎn)地與其無機(jī)元素含量之間的相關(guān)性研究，確定Al、B、Cd、Cu、Mn、Ni、Se、Cr為花椒的特征元素；由PCA和PLS-DA篩選出的主成分或主因子，可以明顯地區(qū)分各產(chǎn)地的花椒，并且PLS-DA模型可以將紅花椒和青花椒區(qū)分；同時(shí)可以根據(jù)各無機(jī)元素與所提取的主成分或主因子之間的關(guān)系，對(duì)各產(chǎn)地及品種的花椒進(jìn)行溯源。