余東亮，石 侃，孟 強(qiáng)，劉樹(shù)文,3,4,*，何 玲

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.秦皇島金士國(guó)際葡萄酒莊有限公司，河北 昌黎 066600；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；4.陜西省合陽(yáng)葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 渭南 715300；5.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）是優(yōu)質(zhì)葡萄酒釀造中必不可缺的工藝技術(shù)[1]。MLF對(duì)葡萄酒具有降酸、改善口感、增加風(fēng)味復(fù)雜性及微生物穩(wěn)定性的重要作用[2]。事實(shí)上，由于乙醇發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒高乙醇含量、低pH值和一定濃度的SO2等嚴(yán)苛條件，常引起MLF的延遲或停滯，加之不同種類葡萄酒乳酸菌的存在，增加了代謝風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)如組胺等的產(chǎn)生，MLF成為相對(duì)于乙醇發(fā)酵更為難以控制的發(fā)酵過(guò)程[3-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，酒類酒球菌（Oenococcus oeni）是營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，卻能更好地適應(yīng)葡萄酒的嚴(yán)苛生境，是推動(dòng)MLF的主導(dǎo)菌及葡萄酒最終質(zhì)量風(fēng)格的塑造者，且它們的MLF發(fā)酵特性存在菌株水平的特異性[7-11]。此外，不同的葡萄酒生境中O. oeni資源存在多樣性和特異性，賦予產(chǎn)品地域特色[12-14]。因此，篩選本土優(yōu)良O. oeni菌株不僅能推動(dòng)MLF順利進(jìn)行，而且能滿足市場(chǎng)對(duì)產(chǎn)品多樣化及產(chǎn)品典型性的需求[15]。Ruiz等[16]從西班牙卡斯蒂利亞-拉曼恰（Castilla La Mancha）產(chǎn)區(qū)丹魄（Tempranillo）葡萄酒中，篩選出本土的O. oeni優(yōu)良菌株C22L9，證實(shí)該菌株賦予葡萄酒獨(dú)特的產(chǎn)區(qū)感官特色。目前，西班牙、意大利、阿根廷和智利等發(fā)達(dá)的葡萄酒生產(chǎn)國(guó)愈加重視并開(kāi)展本土O. oeni優(yōu)良菌株的研究和開(kāi)發(fā)[17-21]。因此，在菌株水平對(duì)我國(guó)葡萄酒產(chǎn)區(qū)O. oeni進(jìn)行遺傳多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育研究，為開(kāi)發(fā)利用我國(guó)本土O. oeni種質(zhì)資源，推動(dòng)我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。O. oeni缺乏錯(cuò)誤修配基因（mutS和mutL，它們具有糾正多種堿基對(duì)的錯(cuò)配，防止產(chǎn)生過(guò)多突變），被認(rèn)為具有超突變性[22]；而一些研究證實(shí)O. oeni不同菌株間存在高度的保守性[23-25]。由于O. oeni這種高突變性和高保守性的矛盾，因此，在對(duì)O. oeni進(jìn)行菌株水平的遺傳研究中，強(qiáng)分辨能力的研究方法十分必要[26]。熒光標(biāo)記擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術(shù)具有操作便捷、分辨率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，為研究O. oeni的自然種群與典型的地理環(huán)境間的遺傳關(guān)系提供了有效途徑[27-29]。

近年來(lái)，在我國(guó)的葡萄酒釀造過(guò)程中，啟動(dòng)MLF的O. oeni商業(yè)制劑幾乎全部來(lái)自國(guó)外，不利于呈現(xiàn)葡萄酒產(chǎn)品的區(qū)域典型性和風(fēng)格，導(dǎo)致產(chǎn)品同質(zhì)化[30]，制約著我國(guó)特色葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。昌黎產(chǎn)區(qū)是我國(guó)政府首批“葡萄酒原產(chǎn)地保護(hù)區(qū)”。該產(chǎn)區(qū)在葡萄酒釀造過(guò)程中，啟動(dòng)MLF的O. oeni商業(yè)制劑幾乎全部來(lái)自國(guó)外的LAFFORT公司和LALLEMAND公司，且型號(hào)單一，致使葡萄酒產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重。因此，本研究采用熒光標(biāo)記AFLP技術(shù)，對(duì)篩選自昌黎產(chǎn)區(qū)不同酒莊的222 株O. oeni進(jìn)行遺傳多樣性和發(fā)育規(guī)律的研究，以期為開(kāi)發(fā)利用我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)內(nèi)本土O. oeni種質(zhì)資源，助力我國(guó)特色葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展，提供方法和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

226 株分離株篩選自昌黎產(chǎn)區(qū)5 家具有代表性酒莊，見(jiàn)表1。O. oeni菌株SD-2a和31-DH作為模式菌株，分別來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。采用葡萄酒生境中分離的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）xja1和xj20，植物乳桿菌（L.plantarum）xj14、xj25和xja2，馬里乳桿菌（L.mali）xja7和xja8作為參照菌株，均來(lái)自西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室[31]。

表1 分離菌株及來(lái)源Table 1 Isolated strains and their origins

蘋果酸監(jiān)測(cè)采用愛(ài)爾蘭Megazyme L-Malic Acid（LMALATE）試劑盒；RNase、DNA polymerase、內(nèi)切酶EcoRI和MseI、T4 DNA Ligase 日本TaKaRa公司；引物及熒光標(biāo)記引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

ATB培養(yǎng)基：1 L含蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，葡萄糖10 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，鹽酸半胱氨酸0.5 g，番茄汁250 g，調(diào)節(jié)pH值至4.8。

ATB固體培養(yǎng)基：每1 L ATB液體培養(yǎng)基加入20 g的瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

C1000基因擴(kuò)增儀 新加坡Bio-Rad公司；Veriti梯度擴(kuò)增儀 美國(guó)基因有限公司；Nanodrop ND-1000核酸蛋白儀 英國(guó)BioDrop公司；ChampGel 500 plus全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣的選取

據(jù)昌黎產(chǎn)區(qū)地理分布特點(diǎn)，選取5 家具有代表性的酒莊，于2016年榨期葡萄酒乙醇發(fā)酵結(jié)束后，立即采用消毒容器從葡萄酒發(fā)酵罐（其中金士小味兒多為5 t發(fā)酵罐，其他均為20 t發(fā)酵罐）中直接取樣，避免接種O. oeni商業(yè)制劑的污染。酒樣基本理化指標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 酒樣基本理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indexes of wine samples

1.3.2 細(xì)菌的分離

酒樣取回后，分裝于消毒后500 mL長(zhǎng)頸燒瓶?jī)?nèi)封好，放置20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，監(jiān)控自發(fā)MLF，一式三份。監(jiān)測(cè)酒樣中蘋果酸含量消耗變化，每個(gè)酒樣分MLF前期、中期（蘋果酸消耗50%～70%）、后期（剩余蘋果酸＜20%）取樣。分別取0.1 mL酒樣，使用0.85%生理鹽水（滅菌）稀釋10－1～10－6梯度，采用O. oeni的ATB分離培養(yǎng)基涂平板[32]，培養(yǎng)皿封嚴(yán)后，于26 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)3～8 d。待平板長(zhǎng)出菌落后，按表型差異（生長(zhǎng)時(shí)間和菌落大小等），挑選單菌落。隨后，采用滅菌ATB培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落培養(yǎng)和劃線分離，反復(fù)純化2 次后，用20%滅菌甘油保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)菌總DNA的提取

參考Cappello等[27]方法有改動(dòng)。分離株和模式菌株于ATB培養(yǎng)基培養(yǎng)，參照菌株于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，均至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取DNA。提取過(guò)程中，添加RNase，提高DNA純度。提取模板DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)質(zhì)量。濃度由Nanodrop ND-1000核酸蛋白儀檢測(cè)。

1.3.4O. oeniSpecies-specific聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

O. oeni特異性引物參照Z(yǔ)apparoli等[33]方法。Forward：5’-TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT-3’；Reverse：5’-ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT-3’。選用反應(yīng)總體積25 μL：2.5 μL 10× PCR Buffer，20 ng DNA模板，5 mmol/L dNTP mixture，上下游引物各500 mmol/L和1 U的DNA polymerase。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性300 s，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸600 s，1 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠系統(tǒng)儀上觀察并記錄結(jié)果。

O. oeni引物特異性驗(yàn)證：采用模式菌株和參照菌株驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。

1.3.5 熒光標(biāo)記AFLP分析[34]

1.3.5.1 雙酶切和連接反應(yīng)

選取內(nèi)切酶EcoRI和MseI組合。反應(yīng)總體積20 μL：約200 ng DNA模板，10 UEcoRI于37 ℃保溫酶切4 h。結(jié)束后直接添加5 UMseI在60 ℃溫育3 h。酶切結(jié)束后80 ℃保溫20 min滅活。然后，添加3 μL的T4 DNA Ligase、EcoRI和MseI接頭，在30 μL總反應(yīng)中，于16 ℃保溫過(guò)夜連接。連接反應(yīng)結(jié)束后，于65 ℃保溫10 min，滅活T4 DNA Ligase。

1.3.5.2 連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增體系25 μL：2.5 μL 10× PCR Buffer，1 μL DNA模板（雙酶切連接產(chǎn)物），5 mmol/L dNTP mixture，上下游引物各500 mmol/L和1 U的DNA polymerase。PCR程序?yàn)椋?4 ℃變性120 s，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸420 s。

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，選擇性擴(kuò)增引物采用已篩選的E1-M1 FAM組合：2.5 μL 10× PCR Buffer，3 μL DNA模板（預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10 倍），5 mmol/L dNTP mixture，上下游引物各500 mmol/L和1 U的DNA polymerase。PCR程序?yàn)椋?4 ℃變性120 s，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s（每個(gè)循環(huán)下降1 ℃），72 ℃延伸120 s，10 個(gè)循環(huán)；然后，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，20 個(gè)循環(huán)；最后，60 ℃延伸30 min，于12 ℃保存。

以上反應(yīng)結(jié)束后，均取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。電泳檢驗(yàn)合格，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)ABI377自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中峰高閾值設(shè)定為100，將AFLP檢測(cè)指紋圖譜，按照等位基因出現(xiàn)條帶記為1（峰高閾值≥100），未出現(xiàn)條帶記為0（峰高閾值＜100），構(gòu)建二進(jìn)制矩陣，采用NTSYS 2.10軟件，基于非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means，UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 O. oeni Species-specific PCR鑒定

2.1.1 O. oeni引物特異性驗(yàn)證

圖1 O. oeni的引物特異性驗(yàn)證PCR電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis profiles of PCR amplification with O. oeni-specific primers

如圖1所示，O. oeni模式菌株31-DH和SD-2a均可擴(kuò)增出唯一、清晰的條帶（泳道1、2），約1 025 bp；分離自葡萄酒生境的短乳桿菌、植物乳桿菌和馬里乳桿菌等參照菌株均未能擴(kuò)增出條帶（泳道4～10），證實(shí)Zapparoli等[33]設(shè)計(jì)的O. oeni Species-specific PCR引物具有典型的特異性。其中，泳道3為分離株11-01，能擴(kuò)增出和模式菌株相同的單一條帶，證實(shí)為O. oeni菌株。隨后，對(duì)分離株均進(jìn)行Species-specific PCR鑒定。

2.1.2 分離株的Species-specific PCR鑒定

來(lái)自昌黎產(chǎn)區(qū)5 個(gè)代表性酒莊的酒樣，經(jīng)自發(fā)MLF，按前、中和后期取樣，采用ATB分離培養(yǎng)基，得到具有表型差異的226 株分離株。226 株分離株均提取有效的DNA，后采用已驗(yàn)證的O. oeni特異性引物進(jìn)行Species-specific PCR鑒定。經(jīng)Species-specific PCR電泳檢測(cè)，222 株分離株被確認(rèn)為O. oeni菌株。4 株分離株1-03、2-26、3-29和3-32經(jīng)電泳檢測(cè)，均沒(méi)有特異性條帶出現(xiàn)，確認(rèn)為非O. oeni菌株。圖2為部分分離株的Species-specific PCR電泳檢測(cè)圖，其中分離株2-26（泳道22）沒(méi)有特異性條帶，其他22 株分離株均呈現(xiàn)約1 025 bp的唯一特異性條帶，因此，確認(rèn)2-26為非O. oeni菌株，其他均為O. oeni菌株。

圖2 部分分離株的Species-specific PCR鑒定電泳結(jié)果Fig. 2 Electrophoresis profiles of selected isolates identified by species-specific PCR

2.2 222 株O. oeni的熒光標(biāo)記AFLP分析

2.2.1 分離株的熒光標(biāo)記AFLP多態(tài)性分析

運(yùn)用熒光標(biāo)記AFLP技術(shù)，采用已篩選的帶有熒光標(biāo)記選擇性引物E1-M1 FAM組合，在222 株分離株中檢測(cè)出287 個(gè)位點(diǎn)條帶，其中呈多態(tài)性位點(diǎn)條帶數(shù)為285 條，多態(tài)性位點(diǎn)比率高達(dá)99.30%。金剛等[35]認(rèn)為O. oeni基因組的G＋C含量在40%左右，建立了基于HindIII和MseI組合的AFLP分析體系?；贖indIII和MseI內(nèi)切酶組合優(yōu)化的選擇性擴(kuò)增引物組合，其多態(tài)性位點(diǎn)比率在10%～52.90%之間，遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)選擇性引物E1-M1 FAM組合的99.30%。隨高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)O. oeni基因組的G＋C含量在37%左右，在多態(tài)性上，內(nèi)切酶EcoRI和MseI的組合屬于AFLP分析的經(jīng)典雙酶切組合[36]，優(yōu)于HindIII和MseI的雙酶切組合。

2.2.2 分離菌株的遺傳多樣性分析

如圖3所示，選擇性熒光標(biāo)記引物E1-M1 FAM組合，可以將分離自昌黎產(chǎn)區(qū)5 個(gè)具有代表性酒莊分離的222 株具有表型差異的O. oeni，區(qū)分為221 個(gè)AFLP遺傳型，相似性系數(shù)為74%～98%。分離株1-02和9-51分別來(lái)自朗格斯赤霞珠和茅臺(tái)赤霞珠，與其他分離株的相似性系數(shù)為74%，是最低的。分離株3-07分離自華夏赤霞珠，與其他菌株的相似性系數(shù)為75%，居其次。分離自金士小味兒多的106 株O. oeni，有105 個(gè)AFLP遺傳型，它們的最小相似性系數(shù)為78%，而菌株11-105和11-106的親緣關(guān)系最近，其相似性系數(shù)為98%。相對(duì)而言，分離自仁軒赤霞珠的25 株O. oeni的最小相似性系數(shù)為82.5%，高于分離自其他酒莊分離株之間的最小相似性系數(shù)。結(jié)果表明，分離自5 個(gè)不同酒莊的222 株O. oeni展現(xiàn)了菌株間豐富的遺傳多樣性。

由此可見(jiàn)，熒光標(biāo)記AFLP技術(shù)對(duì)分離自不同酒莊的O. oeni菌株具有強(qiáng)大的遺傳分型能力，為篩選不同酒莊內(nèi)O. oeni優(yōu)良菌株提供了技術(shù)方法。脈沖場(chǎng)凝膠電泳之前被認(rèn)為是O. oeni最為有效的分型技術(shù)，然而，該方法對(duì)地緣關(guān)系較近的菌株不能實(shí)現(xiàn)有效區(qū)分，且該技術(shù)操作要求高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠穩(wěn)定[37-38]。隨機(jī)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性DNA-PCR在O. oeni分型研究中，具有經(jīng)濟(jì)、快速和高靈敏性的特點(diǎn)，但是存在低重現(xiàn)性的缺陷[39,5]。數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)展示了強(qiáng)有效的遺傳分型能力[40-41]，然而，由于目前對(duì)重復(fù)序列的遺傳功能的認(rèn)識(shí)還有限，基于重復(fù)序列的遺傳分析受到微生物學(xué)家的質(zhì)疑[42]。基于RNA水平的差異顯示PCR技術(shù)受環(huán)境影響大，重現(xiàn)性差[26]。本實(shí)驗(yàn)中，基于全基因組進(jìn)行的雙酶切熒光標(biāo)記AFLP指紋圖譜技術(shù)，精確度高，分辨力強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，不僅將分離自昌黎產(chǎn)區(qū)不同酒莊的O. oeni菌株實(shí)現(xiàn)有效的分型，且對(duì)來(lái)自同一酒莊的O. oeni菌株也可實(shí)現(xiàn)分型。

圖3 昌黎產(chǎn)區(qū)222 株O. oeni的AFLP遺傳圖譜分析Fig. 3 UPGMA dendrogram derived from AFLP patterns of 222 O. oeni strains from Changli

高通量測(cè)序技術(shù)使得對(duì)O. oeni在全基因組水平實(shí)現(xiàn)遺傳分型和發(fā)掘其遺傳進(jìn)化規(guī)律成為可能[43]。然而，酒類酒球菌基因組較小，基于高通量技術(shù)積累的豐富數(shù)據(jù)，如何進(jìn)行深入挖掘和生物信息學(xué)分析，還存在較大的挑戰(zhàn)[44-45]。此外，在O. oeni菌株水平上進(jìn)行遺傳分型的研究中，高通量測(cè)序還存在成本高的問(wèn)題。因而，具有經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、分辨力強(qiáng)的分子標(biāo)記技術(shù)，如熒光標(biāo)記AFLP技術(shù)在O. oeni的遺傳進(jìn)化分析中仍具有不可取代的作用。

2.2.3 分離菌株的遺傳發(fā)育分析

基于UPGMA分析方法，對(duì)分離自昌黎產(chǎn)區(qū)的222 株O. oeni構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。在相似性系數(shù)為81.7%處，222 株分離株呈現(xiàn)出清晰的A和B兩個(gè)主要的進(jìn)化類群。這與國(guó)內(nèi)外基于序列和全基因組分析得出的O. oeni遺傳進(jìn)化規(guī)律是一致的[34,46]。在這2 個(gè)主要類群中，A類群菌株全部分離自朗格斯酒莊、仁軒酒莊和茅臺(tái)酒莊，說(shuō)明這3 個(gè)酒莊的O. oeni菌株具有相近的進(jìn)化關(guān)系；而B(niǎo)類群菌株來(lái)自金士酒莊和華夏酒莊，說(shuō)明它們之間的進(jìn)化關(guān)系較為緊密。事實(shí)上，金士酒莊和華夏酒莊同屬昌黎產(chǎn)區(qū)的碣石山小產(chǎn)區(qū)，地理位置和氣候特點(diǎn)較其他3 個(gè)酒莊更為接近。在A類群中，存在A1、A2、A3、A4和A5共計(jì)5 個(gè)清晰的簇群結(jié)構(gòu)，A1（8/9）和A5（17/18）簇群菌株主要來(lái)自仁軒酒莊，A2（5/5）簇群的菌株分離自朗格斯酒莊，A3（23/26）和A4（8/8）簇群主要分離自茅臺(tái)酒莊，說(shuō)明這些進(jìn)化簇群與它們的分離起源具有清晰的遺傳關(guān)系，同時(shí)，分離自同一酒莊的O. oeni菌株間也存在明顯不同的進(jìn)化發(fā)育途徑。在B類群種，這種進(jìn)化發(fā)育規(guī)律尤為明顯，B1（99/102）簇群幾乎均分離自自金士酒莊，B2（5/5）和B3（21/21）簇群全部分離自華夏酒莊。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，分離自同一酒莊的O. oeni菌株種群形成獨(dú)特的簇群結(jié)構(gòu)，揭示了分離自昌黎產(chǎn)區(qū)的O. oeni分子遺傳發(fā)育規(guī)律與其分離起源存在極為典型的特異性關(guān)系。

此外，分別來(lái)自朗格斯赤霞珠和茅臺(tái)赤霞珠的分離株1-02和9-51處于系統(tǒng)進(jìn)化的最底層，均來(lái)源于17 a樹(shù)齡的赤霞珠（昌黎產(chǎn)區(qū)最早建立的酒莊酒釀酒葡萄基地），或許是昌黎產(chǎn)區(qū)O. oeni的系統(tǒng)發(fā)育起始菌株。

Knight等[13]通過(guò)風(fēng)味化學(xué)分析，驗(yàn)證了具有區(qū)域代表性的釀酒微生物直接對(duì)本區(qū)域葡萄酒風(fēng)格特色的影響，提出釀酒微生物屬于葡萄酒“風(fēng)土”的概念。El Khoury等[14]提出，釀酒微生物是否屬于葡萄酒“風(fēng)土”組成，從微生物學(xué)的角度看，意味著是否存在遺傳獨(dú)特、起源不同的微生物種群結(jié)構(gòu)，對(duì)6 個(gè)世界知名葡萄酒產(chǎn)區(qū)的O. oeni菌株種群進(jìn)行生物地理學(xué)分析，在分子遺傳學(xué)上，發(fā)現(xiàn)不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)存在獨(dú)特的O. oeni的種群結(jié)構(gòu)，推斷O. oeni和釀酒酵母等釀酒微生物同樣屬于葡萄酒“風(fēng)土”的重要組成之一。然而，其研究并未發(fā)現(xiàn)O. oeni種群結(jié)構(gòu)在地理起源上存在遺傳特異性。本研究分離自昌黎產(chǎn)區(qū)不同酒莊的O. oeni種群結(jié)構(gòu)，在分子水平上呈現(xiàn)出清晰的遺傳發(fā)育和分離起源的特異性關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)O. oeni資源是葡萄酒“風(fēng)土”的重要組成之一。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)分離自昌黎產(chǎn)區(qū)5 家具有代表性酒莊的222 株具有表型差異的O. oeni菌株，進(jìn)行熒光標(biāo)記AFLP指紋圖譜分析，區(qū)分為221 個(gè)AFLP遺傳型，證實(shí)熒光標(biāo)記AFLP技術(shù)具有極強(qiáng)的遺傳分型能力，揭示了昌黎產(chǎn)區(qū)O. oeni豐富的遺傳多樣性。通過(guò)UPGMA分析方法，構(gòu)建分離的O. oeni系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以清晰地看到2 個(gè)主要的進(jìn)化類群，極其重要的是，分離自同一酒莊的O. oeni菌株種群形成了獨(dú)特的簇群結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出遺傳發(fā)育和分離起源的典型特異性關(guān)系，證實(shí)了O. oeni資源是葡萄酒“風(fēng)土”的重要組成之一。研究結(jié)果證實(shí)了昌黎產(chǎn)區(qū)存在豐富的O. oeni資源，且不同酒莊的O. oeni資源呈現(xiàn)出典型的遺傳特異性，這為開(kāi)發(fā)我國(guó)具有地域特色的O. oeni資源提供了技術(shù)和理論支持。