寧亞麗，吳 躍*，何 嬙，徐帥哲，陳 艷

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

米酒作為我國一種傳統(tǒng)發(fā)酵酒，通常以米類作物為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成，其不僅風味獨特，還富含豐富營養(yǎng)成分，具有特色食療功能[1]，在我國南方和北方一些地區(qū)非常盛行。近年來，朝鮮族米酒作為東北吉林延邊朝鮮族的一種特色傳統(tǒng)發(fā)酵米酒，因其米香濃郁，較南方米酒酸甜可口，口感醇和，類似飲料風味，深受男女老少喜愛，逐漸在我國流行。

我國米酒發(fā)展有悠久的歷史，不同區(qū)域的米酒呈現(xiàn)出不同的風味和口感，其中具有代表性的傳統(tǒng)米酒有孝感米酒、福建紅曲米酒、信陽米酒、陜北米酒、朝鮮族米酒等。孝感米酒是湖北地區(qū)一種米酒，是以優(yōu)質(zhì)糯米為原料和傳統(tǒng)鳳窩酒曲發(fā)酵而成，其酒白如玉液，甜潤可口；福建紅曲米酒是由糯米和紅米為原料，紅曲為發(fā)酵劑釀造而成，以色紅、味醇、香濃著稱；信陽米酒由糯米為原料，利用小曲發(fā)酵而成，甘飴可口；陜北米酒主要由黃米或小米為原料，與當?shù)鼐魄l(fā)酵而成，呈黃色，口味略甜且?guī)姿嵛?。而朝鮮族米酒是一種以粳米或糯米為主要原料，利用當?shù)貍鹘y(tǒng)酒曲為發(fā)酵劑，經(jīng)過浸米、熬煮（或蒸米）、糖化、發(fā)酵、過濾、調(diào)配等工序釀制而成，其乙醇體積分數(shù)為4%～6%[2]，口感酸甜可口，但略偏酸，因其酒體為乳白色或微黃色，又被稱為濁酒。其酒曲是以糯米粉和發(fā)芽玉米粉為原料，加水混合制成曲坯，自然接種環(huán)境中的微生物而成。

中國米酒文化源遠流長，但關(guān)于朝鮮族米酒記錄的文獻很少。而與我國朝鮮族米酒相似的韓國米酒目前在世界范圍內(nèi)享受聲譽，韓國對其米酒和酒曲Nuruk進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)Nuruk酒曲中絲狀真菌、酵母菌和細菌對韓國米酒的品質(zhì)和風味起到至關(guān)重要的作用[3]。據(jù)報道，韓國米酒具有多種功能特性，包括抗癌、抗高血壓、抗氧化，促進血液循環(huán)等功效[4-5]。而我國對朝鮮族米酒及其酒曲研究僅主要集中在其釀造及制曲工藝上[2,6]，對米酒及其酒曲中微生物種類研究很少。高通量測序技術(shù)是目前研究微生物多樣性中應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)，不僅能夠快速地分析復(fù)雜微生物群落多樣性，還能檢測到低存在率及不可培養(yǎng)的微生物，現(xiàn)在該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于酸奶[7]、泡菜[8]、白酒[9]、醋[10]等生物群落結(jié)構(gòu)研究，因此本研究采用高通量測序技術(shù)研究朝鮮族酒曲及其發(fā)酵后米酒中微生物群落多樣性。

本研究以朝鮮族米酒及其酒曲為研究對象，采用Ilumina HiSeq和Illunina MiSeq高通量測序平臺對細菌的16S rDNA V3區(qū)和真菌ITS1區(qū)進行測序，更全面地呈現(xiàn)朝鮮族米酒及其酒曲的微生物群落多樣性，剖析各類微生物的結(jié)構(gòu)比例，明確優(yōu)勢菌群；以此更好地提高朝鮮族米酒品質(zhì)，推動其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，為現(xiàn)代化釀酒新工藝的建立提供理論依據(jù)，對推廣民族特色發(fā)酵食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酒原料為東北粳米（珍珠米），產(chǎn)自黑龍江通河；酒曲為采集自吉林延邊朝鮮族自治州家庭當年手工制作的新酒曲。

DNA提取試劑盒（DP328）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP208） 北京天根生物科技有限公司；強力土壤?DNA提取試劑盒 美國MOBIO公司；Taq酶、引物等 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；精密膜過濾器 煙臺帝伯仕自釀機有限公司；C1000型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc 2000型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；水平電泳儀、電泳槽 北京市六一儀器廠；5427R型低溫離心機 德國Eppendorf公司；SI-A256型渦旋機 美國Scientific Industries公司；MiSeq PE300測序儀、HiSeq 2500測序儀 美國Illuimina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備及采集

參照文獻[2]方法，結(jié)合當?shù)毓に囍苽涑r族米酒。具體為：先將粳米浸潤5～6 h，然后以質(zhì)量比1∶5的米水比熬煮至粥狀，攤冷冷卻至室溫，按大米質(zhì)量的3%加曲拌勻后，入罐密封發(fā)酵，溫度32 ℃，發(fā)酵3 d，得米白色酒醪，于4 ℃冷藏3 d，過80 目篩進行粗濾得米酒樣品CL；在此基礎(chǔ)上，為使顏色更澄清，采用濾芯膜為0.22 μm精密膜過濾器精濾得米酒樣品JL。工藝流程如下：

1.3.2 樣品總DNA提取

將酒曲用研缽粉碎，用五分法取3 份平行樣品，分別編號JQ1、JQ2、JQ3；每種形式米酒分別取兩份平行，粗濾形式米酒編號為CL1、CL2，精濾形式米酒編號為JL1、JL2。分別稱取酒曲和2 種形式米酒樣品各200 mg，分別用DNA提取試劑盒和強力土壤?DNA提取試劑盒對樣品中細菌、真菌DNA進行提取，提取方案按試劑盒說明書進行。

1.3.3 PCR擴增及測序

對細菌16S rDNA的V3可變區(qū)和真菌的ITS1可變區(qū)進行擴增，具體引物見表1。

表1 細菌、真菌的PCR擴增引物設(shè)計Table1 1 Primers used for PCR amplification of bacterial 16S rDNA V3 variable region and fungal ITS1 variable region

細菌PCR體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA模板 2 μL，Taq酶0.25 μL，引物338F 2 μL，引物518R 2 μL，用dd H2O補至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min（30 次循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min。

真菌巢式第1輪P C R體系（5 0 μ L）：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA模板2 μL，Taq酶0.25 μL，引物ITS1F 2 μL，引物ITS2 2 μL，用dd H2O補至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min（35 次循環(huán)），最后72 ℃保溫10 min。真菌巢式第2輪PCR體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，DNA模板36.75 μL，Taq酶1 μL，引物ITS1F 2 μL，引物ITS2 2 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（5 次循環(huán)），最后72 ℃保溫10 min。

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP208）PCR純化產(chǎn)物，建庫并于Illumina MiSeq和Illumina HiSeq測序平臺上機分別對樣品中的細菌和真菌序列測序，測序工作委托北京理化分析測試中心完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode將下機數(shù)據(jù)，拆分成不同樣品，去除Barcode序列和PCR擴增引物序列。使用FLASH（version 1.2.7）軟件，通過Overlap對每個樣品的reads進行拼接，得到原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags），再使用Trimmomatic （version 0.33）軟件，對原始Tags數(shù)據(jù)進行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags），最后使用UCHME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。

將最終有效數(shù)據(jù)用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUS在97%的相似度水平下進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，利用Mothur（version v.1.30）軟件對樣品的α-多樣性進行評估，并基于細菌Silva和真菌UNITE分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋，生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用Excel和Origin分別繪制樣品各分類學水平下的群落結(jié)構(gòu)圖、主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-多樣性分析

α-多樣性反映了單個樣品內(nèi)部物種的多樣性，根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息，采用α-多樣性指標的覆蓋率、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。

表2 α-多樣性指數(shù)Table 2 Microbial α-diversity index of samples

每個樣品的覆蓋率、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)分別用于評估物種的測序深度、豐度和多樣性。覆蓋率反映了樣本的真實情況，該指數(shù)越高，則樣本中序列未被測出的概率越低；Chao指數(shù)是群落豐度指數(shù)，Chao指數(shù)越大，表明樣品微生物群落豐度越高；Shannon指數(shù)是群落分布多樣性指數(shù)，Shannon指數(shù)越大，表明樣品微生物多樣性越高；OTU數(shù)量亦可以代表樣品物種的豐度。由表2可知，酒曲與2 種形式米酒中微生物覆蓋率都大于0.9，說明樣品文庫中序列基本上都被測出，即樣本測序結(jié)果可以反映樣品的真實情況。就細菌而言，酒曲樣品中細菌平均Chao指數(shù)與米酒樣品差異不大，但酒曲樣品中OTU數(shù)量明顯高于2 種米酒樣品，說明酒曲中細菌群落豐度比米酒高。酒曲樣品中細菌Shannon指數(shù)也明顯高于2 種米酒樣品，說明酒曲中細菌群落多樣性高于粗濾和精濾米酒，同時精濾米酒中細菌群落多樣性較粗濾米酒略有降低。就真菌而言，根據(jù)Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)可知，酒曲樣品中真菌群落豐度低于2 種米酒，而多樣性高于2 種米酒；同時，精濾米酒中真菌群落多樣性明顯低于粗濾米酒。

從α-多樣性指數(shù)可以得出，酒曲和米酒樣品中細菌物種豐度顯著高于真菌，但在米酒產(chǎn)品中，真菌豐度大幅增加，可能是由于發(fā)酵后的米酒中的優(yōu)勢菌群為霉菌和酵母；米酒的精濾工藝對微生物群落均有一定影響，但對真菌微生物群落影響較明顯，可能是由于真菌形態(tài)較大，易被過濾掉。

2.2 酒曲與米酒間細菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖1 門水平下酒曲與米酒樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 1 Distribution of bacterial communities in the starter culture and rice wines at the phylum level

在門水平下，酒曲和米酒樣品一共鑒定出25 個細菌物種，圖1顯示豐度水平前14的物種，其他物種合并為others。由圖1可知，酒曲中主要細菌優(yōu)勢菌門分別為：平均相對豐度為37.68%的變形菌門（Proteobacteria）、4.58%的厚壁菌門（Firmicutes）、4.28%的藍藻菌門（Cyanobacteria）和4.20%的放線菌門（Actinobacteria）；2 種米酒樣品中細菌主要優(yōu)勢菌群與酒曲相同，但是相對豐度差異較大，即粗濾米酒這4 種菌門的平均相對豐度分別為18.14%、21.17%、5.15%、1.24%，精濾米酒平均相對豐度分別為13.26%、23.28%、4.37%、1.08%。說明在門水平下，酒曲中細菌群落結(jié)構(gòu)組成與2 種米酒相同，僅組成比例存在一定差異，而2 種形式米酒間細菌群落結(jié)構(gòu)組成及其比例均相似，即精濾工藝對米酒中門水平下細菌群落結(jié)構(gòu)無明顯影響。在酒曲樣品中，變形菌門為絕對優(yōu)勢菌群，而2 種米酒的絕對優(yōu)勢菌群為厚壁菌門，這可能是由于變形菌門的一部分細菌為好氧型，不能適應(yīng)米酒發(fā)酵過程中缺氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)醇的環(huán)境，因而豐度降低；而厚壁菌門中的乳桿菌和乳球菌大多數(shù)為厭氧細菌，能夠產(chǎn)酸且在高酸環(huán)境下生長[11]，因而其豐度在米酒產(chǎn)品中增加。本研究酒曲中藍藻菌門平均相對豐度為4.28%，可能來源酒曲原料中植物中的葉綠體。

圖2 屬水平下酒曲與米酒樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 2 Distribution of bacterial communities in the starter culture and rice wines at the genus level

在屬水平下，酒曲和米酒樣品中一共檢測出147 個細菌物種，圖2顯示豐度前17的物種，其他物種合并為others。由圖2可知，酒曲中主要細菌分別為平均豐度5.00%的假單胞菌屬（Pseudomonas）、4.28%的腸桿菌屬（Enterobacter）、1.21%的魏斯氏菌屬（Weissella）、1.11%的棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、0.53%的歐文氏菌屬（Erwinia）和0.47%的不動桿菌屬（Acinetobacter）。2 種米酒中主要細菌均為乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬、球菌屬（Tetragenococcus）、棒狀桿菌屬，其中粗濾米酒中這7 類菌群的平均相對豐度分別為3.72%、6.31%、3.38%、3.44%、2.25%、1.39%、0.68%，精濾米酒中相對豐度為7.73%、4.41%、3.73%、1.66%、2.71%、1.08%、0.90%。說明酒曲與米酒樣品中屬水平下細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大；而2 種米酒間細菌菌群組成相似，只是豐度有所差異。腸桿菌屬和假單胞菌屬是酒曲樣品中的優(yōu)勢菌群，而隸屬于乳酸菌的乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌在米酒樣品中大幅增加，成為米酒樣品的優(yōu)勢菌。這與韓國米酒中發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬細菌在米酒發(fā)酵階段逐漸成為優(yōu)勢菌結(jié)果一致[12]。乳酸菌在米酒發(fā)酵過程中能利用發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸等，降低米酒中的pH值，并且乳酸與乙醇發(fā)生反應(yīng)生成酯類是米酒重要的風味物質(zhì)，同時乳酸菌代謝過程中產(chǎn)生乙酰和雙乙酰，賦予米酒特色風味[13-14]。另外乳酸菌能生成具有抗菌作用的細菌素[15]，這對抑制米酒中致病、致腐菌具有重要意義。腸桿菌屬一般為非條件致病菌或條件致病菌，部分為人體腸道內(nèi)正常微生物，能利用糖酵解和戊糖磷酸途徑對糖進行降解產(chǎn)生有機酸[16]，該屬細菌在酒曲和精濾米酒樣品中豐度差異不大，但在粗濾米酒中豐度增加。而假單胞菌屬多為條件致病菌，且為嚴格好氧菌[17]，該屬細菌幾乎不能在酸性、缺氧的條件下生長，因而在米酒產(chǎn)品中比例大幅下降。

本研究通過高通量測序技術(shù)研究朝鮮族米酒及其酒曲中細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，酒曲中優(yōu)勢細菌主要為假單胞菌屬和腸桿菌屬，其米酒中優(yōu)勢細菌主要為乳桿菌屬、腸桿菌屬。Lü Xucong等[18]用PCR-DGGE對紅曲糯米酒的酒曲微生物群落進行分析，表明其主要細菌為芽孢桿菌和乳酸菌，如人參土芽孢桿菌（Bacillus ginsengihumi）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。Song等[3]收集韓國各地區(qū)42 份Nuruk酒曲分析微生物群落，發(fā)現(xiàn)在所有的酒曲中主要的優(yōu)勢菌是芽孢桿菌屬（Bacillus），如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。芽孢桿菌屬具有很高的α-淀粉酶和糖化酶活性[19]，對米酒糖化有利，而本研究不論是在酒曲中還是在米酒中，都未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌。可能是由于酒曲原料和制作工藝的不同，導(dǎo)致了酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)有所不同。Cai Haiying等[20]研究孝感米酒微生物群落發(fā)現(xiàn)，其主要優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬，其中乳桿菌屬也是本研究2 種朝鮮族米酒中的優(yōu)勢菌。本研究在米酒和酒曲中發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬，該類菌屬中有一部分細菌產(chǎn)酸，在米酒發(fā)酵過程中，乳桿菌屬和腸桿菌屬可能會共同產(chǎn)酸，因而導(dǎo)致了朝鮮族米酒酸味口感突出。

2.3 酒曲與米酒間真菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

圖3 門水平下酒曲與米酒樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 3 Distribution of fungal communities in the starter culture and rice wines at the phylum level

在門水平下，從酒曲和米酒樣品中一共鑒定出5 個真菌物種，但酒曲中有0.16%、米酒中有1.12%為未被鑒定出物種和酒曲中0.06%、米酒中0.15%比例為未知物種。由圖3可知，酒曲和米酒門水平下真菌群落均主要是子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）。酒曲和米酒中絕對優(yōu)勢菌群均為子囊菌門，二者中的相對平均豐度分別為85.9%、98%。子囊菌門的真菌群落在米酒產(chǎn)品中豐度大幅增加并占有絕對主導(dǎo)，說明其在米酒發(fā)酵中起重要作用。而擔子菌門相對豐度由酒曲中15.31%降低至米酒中0.18%，表明擔子菌門真菌群落可能在低氧、酸性、高醇的環(huán)境下難以生存。毛霉亞門真菌群落的相對豐度由酒曲中2.3%增加至粗濾米酒中5.3%，而在精濾米酒中顯著降低至0.7%，這可能是由于毛霉在米酒發(fā)酵過程中有一定的糖化力[21]，而又由于毛霉菌絲體較大，不能通過精濾設(shè)備的0.22 μm的篩孔，因此，粗濾米酒中其豐度增加，而精濾米酒中降低。

圖4 屬水平下酒曲與米酒樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 4 Distribution of fungal communities in the starter culture and rice wines at the genus level

在屬水平下，從酒曲和米酒中一共鑒定出12 個真菌物種，圖4顯示豐度前10的物種，但酒曲中有1.28%、米酒中有5.23%為未被鑒定出物種和酒曲中5.88%、米酒中20.85%為未知物種。如圖4所示，酒曲中真菌群落與米酒中存在較大差異，米酒間真菌群落組成相似，但豐度有所差異。酒曲中優(yōu)勢菌屬是青霉菌屬（Penicillium）和蘭久浩酵母屬（Guehomyces），平均相對豐度分別為49.45%、10.28%；粗濾米酒樣品中優(yōu)勢菌屬為酵母屬（Saccharomyces）和絲孢畢赤氏酵母屬（Hyphopichia），相對豐度分別為50.93%、30.15%；精濾米酒中，真菌群落比例發(fā)生一定變化，優(yōu)勢菌屬亦為酵母屬和絲孢畢赤酵母屬，豐度分別增至84.12%、降至6.47%。青霉具有很強產(chǎn)葡萄糖淀粉酶能力，對大米淀粉具有重要水解作用[22]，但隨著發(fā)酵時間延長，米酒體系中有機酸和醇不斷積累，破壞青霉的生長環(huán)境，因而其比例在米酒樣品中大幅降低。目前，在其他酒曲和米酒中較少發(fā)現(xiàn)有報道蘭久浩酵母屬，Bhadra等[23]研究發(fā)現(xiàn)蘭久浩酵母屬能夠在用于乙醇發(fā)酵的含糖基質(zhì)上生長。酵母屬具有較強的發(fā)酵能力、高產(chǎn)乙醇能力，乙醇耐受性強，是白酒釀造過程中最主要的功能菌株[24-25]，因此其含量在米酒樣品中持續(xù)增加，一躍成為米酒中的優(yōu)勢菌。絲孢畢赤酵母屬是發(fā)酵飲料中常見的產(chǎn)香酵母，對米酒有增香作用[26]，但有可能該類酵母菌體大，不能通過0.22 μm篩孔的精濾設(shè)備，因而其比例在粗濾米酒中增加，精濾米酒中降低。

圖5 種水平下酒曲與米酒樣品真菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 5 Distribution of fungal communities in the starter culture and rice wines at the species level

在種水平下，酒曲和米酒中一共鑒定出12 個物種，圖5顯示豐度前10的物種，但酒曲中有0.99%、米酒中有3.01%比例合并為others，酒曲中10.52%、米酒中78.21%比例為未知物種。由圖5可知，酒曲中主要真菌為：平均相對豐度為10.22%的普魯蘭久浩酵母（Guehomyces pullulans）、3.41%的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、1.56%的枝孢霉（Cladosporium delicatulum）、1.16%總狀毛霉（Mucor racemosus）、1.15%波蘭青霉（Penicillium polonicum）等。普魯蘭久浩酵母屬于耐冷酵母，在低溫下有高活性，是一種能高產(chǎn)乳糖酶的菌株[27]，目前在東北的酸湯子玉米面團[28]和黏豆包[29]中有發(fā)現(xiàn)，因此，可以推斷出該菌株為東北地區(qū)特色菌種；并有研究表明普魯蘭久浩酵母能夠在用于乙醇發(fā)酵的含糖基質(zhì)上生長，說明普魯蘭久浩酵母在米酒發(fā)酵過程中產(chǎn)醇[23]。異常威克漢姆酵母是一種產(chǎn)香酵母，具有較高的產(chǎn)3-甲基-1-丁醇能力[30]，對米酒的風味有很好的貢獻作用。另外，枝孢霉是一種植物中的內(nèi)生真菌，推測可能來源于制作酒曲的各種植物原料中；總狀毛霉具有產(chǎn)淀粉酶和脂肪酶的能力[31]，對糖化有利；波蘭青霉通常在谷物、玉米、肉制品中都存在，本酒曲中的波蘭青霉可能來源于酒曲原料的發(fā)芽玉米粉和糯米粉。米酒中主要真菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）、異常威克漢姆酵母、卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和少根根霉（Rhizopus arrhizus）等。其中，粗濾米酒中釀酒酵母平均相對豐度為49.48%、伯頓絲孢畢赤酵母為29.47%，精濾米酒中其相對豐度分別為81.52%、6.43%。釀酒酵母是釀酒過程主要的功能菌株[25,32]，有很強的發(fā)酵能力，高產(chǎn)乙醇，因此在米酒中比例持續(xù)增加；伯頓絲孢畢赤酵母是釀酒過程中的產(chǎn)香酵母，具有較強的產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯乙醇能力[24]，能夠賦予米酒濃郁的花香味。此外，卷枝毛霉在我國甜酒曲以及韓國酒曲Nuruk中均有發(fā)現(xiàn)[3,33]，其可以在菌絲內(nèi)積累大量具有治療心血管疾病、降低膽固醇等功能的脂肪酸[34]。米酒中扣囊復(fù)膜酵母也是產(chǎn)香酵母，具有良好的產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯等風味物質(zhì)能力[26]，能夠賦予米酒果香味；少根根霉具有較高的淀粉酶活力，并能產(chǎn)生脂肪酶[35]，能夠有效地分解大米中淀粉和脂肪。

研究朝鮮族米酒及其酒曲中微生物群落發(fā)現(xiàn)，酒曲中優(yōu)勢菌主要為青霉菌屬和蘭久浩酵母屬，其米酒中優(yōu)勢菌主要為酵母屬和絲孢畢赤氏酵母屬。與本研究不同，Ponnusamy等[36]研究韓國米酒Nuruk酒曲制備過程中微生物群落，表明米曲霉（Aspergillus oryzae）是其主要真菌。Park等[37]報道，紅曲米酒發(fā)酵前期主要優(yōu)勢菌為米根霉（Rhizopus Oryzae）、季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii），后期為釀酒酵母，該結(jié)果與本研究結(jié)果類似，說明在米酒發(fā)酵后期，釀酒酵母是優(yōu)勢菌，且在產(chǎn)品中起著至關(guān)重要的作用。而研究孝感米酒中真菌群落發(fā)現(xiàn)，其優(yōu)勢菌主要為根霉菌屬（Rhizopus）、曲霉菌屬（Aspergillus）、酵母屬[20]；與之不同，本研究的朝鮮族米酒中少量存在根霉菌屬，不存在曲霉菌屬。Lü Xucong等[38]從10 份紅曲米酒酒曲中分離鑒定絲狀真菌，發(fā)現(xiàn)米根霉、米曲霉、黃曲霉（Aspergillus flavus）很強的α-淀粉酶或糖化酶活性，這表明曲霉屬和根霉屬在米酒發(fā)酵過程中能夠有效地分解淀粉，增加小分子糖的含量，因而使米酒含糖量高且口感偏甜。而朝鮮族米酒中根霉含量少，曲霉不存在，使米酒在發(fā)酵過程中淀粉降解程度偏低，因而酸味口感突出。

2.4 酒曲與米酒間微生物群落相似性分析

主成分分析可以直觀地將樣品間相似或差異程度體現(xiàn)在二維坐標圖上，距離越近則表示越相似。如圖6所示，主成分1和主成分2分別解釋了酒曲與米酒樣品中細菌群落95.61%和3.83%的信息，兩主成分之和大于80%，則表明兩個成分較好地代表了樣品中的細菌群落信息。3 份酒曲平行樣品距離米酒樣品有一定距離，說明酒曲中細菌群落與米酒有一定差異；相比之下，2 種米酒間樣品距離較近，差異不大，說明米酒間的細菌群落相似性高，這與細菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析一致。由圖7可知，真菌群落主成分析的兩個主成分分別解釋了酒曲與米酒中真菌群落90.81%和7.47%的信息，也較好地代表了樣品中真菌群落信息，說明酒曲中真菌群落與米酒樣品中存在一定差異，米酒間真菌群落相似性要低于細菌群落，說明精濾工藝對米酒中真菌群落影響較大。

圖6 酒曲與米酒樣品中細菌群落主成分分析圖Fig. 6 Principal coordinate analysis of bacterial communities in the starter culture and rice wines

圖7 酒曲與米酒樣品真菌群落主成分分析圖Fig. 7 Principal coordinate analysis of fungal communities in the starter culture and rice wines

3 結(jié) 論

本研究通過高通量測序技術(shù)對朝鮮族傳統(tǒng)米酒及其酒曲中微生物多樣性進行分析，對其中優(yōu)勢菌群組成進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，朝鮮族米酒中主要優(yōu)勢菌為乳桿菌屬、腸桿菌屬、酵母屬和絲孢畢赤氏酵母屬；而酒曲中主要優(yōu)勢菌為假單胞菌屬、腸桿菌屬、青霉菌屬和蘭久浩酵母屬，這表明，朝鮮族米酒與其他種類米酒及其酒曲中微生物菌群存在顯著差異。研究還表明，精濾工藝對米酒的微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大，但對微生物豐度有一定的影響。該結(jié)果能夠為日后深入研究朝鮮族米酒及酒曲微生物提供借鑒與參考，也能為進一步開發(fā)品質(zhì)安全、風味優(yōu)良的朝鮮族米酒提供理論支持。