劉洪林，曾藝濤，趙 欣,*

（1.重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶市輔仁中學(xué)校，重慶 400067）

中國(guó)的6 大茶類均含有大量的多酚類化合物，因發(fā)酵程度不同而存在于不同的化合物中。綠茶中含有大量未氧化的兒茶素包括(－)-兒茶素（gallocatechin，GC）、(－)-表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、(＋)-兒茶素（catechin，C）、(－)-表兒茶素（epicatechin，EC）、(－)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，GCG）、(－)-表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）和(－)-兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）；兒茶素的氧化衍生物茶黃素（theaflavins，TFs）和茶紅素（thearubigins，TRs）存在于部分發(fā)酵茶（烏龍茶、黃茶和白茶）、全發(fā)酵茶（紅茶）和后發(fā)酵茶（黑茶）中[1-3]。6 大茶類中綠茶兒茶素的含量是最高的，而紅茶、黑茶等因其氧化時(shí)間較長(zhǎng)而大大減少。兒茶素是主要的活性成分，綠茶中占干質(zhì)量的25%。

由于茶中多酚類化合物的健康益處，各制造商試圖生產(chǎn)出多酚含量高的茶葉產(chǎn)品。然而，茶葉生產(chǎn)中多酚的含量和穩(wěn)定性取決于多種因素，如品種、收獲季節(jié)、植物的年齡、氣候、環(huán)境條件和加工條件[4]。在這些因素中，加工條件是決定茶葉產(chǎn)品質(zhì)量的最重要因素之一。目前，研究加工對(duì)茶葉多酚含量的影響，主要集中在綠茶中[5-10]和紅茶[11-13]，很少有研究關(guān)注烏龍茶[14-15]。這可能是因?yàn)槿澜缛藗冿嬘米疃嗟牟桀愂羌t茶（78%），其次是綠茶（20%），而烏龍茶在世界范圍內(nèi)的消費(fèi)量?jī)H為2%?，F(xiàn)如今，烏龍茶在世界上越來越受歡迎，但與對(duì)綠茶和紅茶中活性成分的積極研究相比，對(duì)烏龍茶的研究卻少得多。

烏龍茶中兒茶素有EC、EGC、ECG、EGCG、C、GC、CG、GCG，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。這些兒茶素在茶葉中含量高，對(duì)健康有益[16-17]。兒茶素的鑒定與測(cè)定一直是烏龍茶化學(xué)控制的重點(diǎn)[9,18-19]，因此，茶葉生產(chǎn)商試圖生產(chǎn)高兒茶素含量的烏龍茶，以應(yīng)對(duì)日益增長(zhǎng)的功能性食品市場(chǎng)。然而，兒茶素的含量和穩(wěn)定性取決于加工過程中的多種因素[6,9,20]。

烏龍茶中兒茶素在加工過程中會(huì)發(fā)生化學(xué)變化，如差向異構(gòu)化作用和降解反應(yīng)[21-22]，這些反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致現(xiàn)在的商業(yè)茶飲兒茶素含量略有下降。因此，對(duì)兒茶素在加工和貯存過程后在飲茶水溶液中的穩(wěn)定性進(jìn)行了大量研究[23-24]，但在烏龍茶加工過程中的研究卻鮮見報(bào)道。特別是在剛開始的鮮葉采摘、烏龍茶嚴(yán)格由同一位專家控制的情況下加工過程中關(guān)于兒茶素變化的相關(guān)研究更為鮮見。要生產(chǎn)高品質(zhì)的烏龍茶，高含量的兒茶素是因素之一，故了解烏龍茶加工過程中酚類化合物的穩(wěn)定性，以獲得最佳的健康效益非常重要。因此，本實(shí)驗(yàn)研究加工過程中烏龍茶中兒茶素的變化，評(píng)價(jià)每道加工工藝對(duì)烏龍茶生產(chǎn)中兒茶素變化的影響，以期為烏龍茶加工技術(shù)提供一定的參考數(shù)據(jù)，為茶葉產(chǎn)業(yè)提供酚類化合物的確切信息。

圖1 兒茶素、咖啡因和沒食子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of catechins, caffeine and gallic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：包括GC（≥98%）、EGC（≥98%）、C（≥98%）、EC（≥90%）、EGCG（≥95%）、GCG（≥98%）、ECG（≥98%）、CG（≥98%） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Folin-Ciocalteu試劑、乙腈、三氟乙酸、甲醇（均為色譜純） 瑞士Fluka公司；無水碳酸鈉德國(guó)默克公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Whatman No.4濾紙 美國(guó)Whatman有限公司；0.45 μm聚四氟乙烯過濾器 美國(guó)貝德福德微孔有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Aglient公司；Platinum EPS C18液相色譜柱（53 mm×7 mm，3 μm） 美國(guó)Whatman公司；DFT-200型200 g手提式粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；FA2004A型分析天平 海津天電子儀器有限公司；Mili-Q超純水儀 美國(guó)密理博公司；Centrifuge5810高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TU 1900型雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 烏龍茶加工

在福建武夷山采取同一地點(diǎn)生長(zhǎng)的12 個(gè)品種的一芽二葉采取烏龍茶加工工藝對(duì)茶葉進(jìn)行加工。實(shí)驗(yàn)開始前對(duì)烏龍茶的加工工藝進(jìn)行了調(diào)查，將每個(gè)品種采摘的鮮葉分成3 組，然后加工成烏龍茶（發(fā)酵程度約為10%～20%）。采摘、萎凋、做青、殺青、揉捻、烘焙每個(gè)加工工藝步驟后采集茶葉樣本（250 g），每一道工藝抽取3 個(gè)樣本。分析之前立即用聚丙烯塑料袋真空包裝和－20 ℃貯存樣本大約3～5 d，備用。

1.3.2 樣本提取

由于從各加工工藝收集的茶葉樣本水分含量不同，因此稱取樣本的質(zhì)量不同。對(duì)采摘后的鮮葉、萎凋、做青、殺青、揉捻、烘焙步驟分別稱量茶樣10、10、10、5、2 g和2 g（精確到0.001 g）。茶葉樣本細(xì)磨成粉和200 mL 80 ℃蒸餾水用攪拌機(jī)或均質(zhì)器提取15 min，提取的混合物（渣用蒸餾水洗凈（3×10 mL））通過濾紙（Whatman No. 4）過濾，將過濾后的茶湯冷卻至室溫，用蒸餾水調(diào)至250 mL。所有樣品均為一式3 份，備用。

1.3.3 各兒茶素單體、TCC測(cè)定

采用ISO方法[25]對(duì)各兒茶素單體、兒茶素總量（TCC，8 種兒茶素單體的總和）進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行細(xì)微修改。GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG標(biāo)準(zhǔn)曲線制定：將標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容至1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，混合標(biāo)準(zhǔn)母液是通過混合每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)母液的等量體積制備。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品（蒸餾水稀釋10 倍）透過0.45 μm聚四氟乙烯過濾器過濾并進(jìn)行HPLC分析。利用Platinum EPS C18反相色譜柱（53 mm×7 mm，3 μm），柱溫30 ℃。流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.05%三氟乙酸溶液，B相為乙腈溶液，A、B相體積比為87∶13，流速2 mL/min。進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)各兒茶素單體進(jìn)行量化，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為 ±s。利用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析

利用AOAC國(guó)際指南對(duì)膳食補(bǔ)充劑和植物制劑的化學(xué)方法進(jìn)行單實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證[26]方法HPLC結(jié)果驗(yàn)證。通過比較在190～400 nm紫外光譜標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的的保留時(shí)間鑒別兒茶素、沒食子酸和咖啡因。校準(zhǔn)曲線的繪制是用9 種水平構(gòu)成的，覆蓋了茶葉樣品預(yù)期的質(zhì)量濃度范圍。由表1得知，GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG的線性檢測(cè)范圍質(zhì)量濃度分別為0.10～51.9、0.09～43.1、0.20～100.0、0.19～97.0、0.16～80.0、0.11～52.9、0.20～98.0、0.09～44.1 μg/mL。所有分析物相關(guān)系數(shù)R2范圍為0.996 5～0.999 9，均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表1 8 種兒茶素單體測(cè)定的線性相關(guān)性Table 1 Linear equations for 8 individual catechins

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品（A）、鮮葉（B）和烏龍茶（C）的HPLC圖Fig. 2 Typical chromatograms of standard compounds (A), fresh tea shoots (B) and Oolong tea from drying step (C)

如圖2所示，烏龍茶加工開始和結(jié)束之間的HPLC圖存在差異。在鮮葉中檢測(cè)到7 個(gè)兒茶素單體，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較保留時(shí)間和真實(shí)值，從左到右被鑒定為GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG，未檢出CG。將HPLC峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，對(duì)GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG進(jìn)行量化。發(fā)現(xiàn)鮮葉中兒茶素含量中，EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為（4.94±0.28）%；其次是EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.92±0.14）%；EGC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.90±0.24）%，C質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.66±0.17）%，ECG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.16±0.08）%；微量的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.37±0.04）%，GCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.26±0.03）%。根據(jù)兒茶素單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)得到兒茶素總量為（12.25±0.17）%。這些結(jié)果與之前報(bào)道一致[27-29]，然而，研究發(fā)現(xiàn)個(gè)別品種酚類化合物的含量存在差異。這可能是由于化合物的種類和含量受到許多因素的影響，包括子品種和品種種類、生長(zhǎng)環(huán)境的要素和采收條件等[27-29]。

2.2 TCC和兒茶素單體含量的變化

表2 茶葉中TCC和兒茶素單體的含量Table 2 Contents of total catechins and individual catechins in tea samples from each processing step%

如表2所示，鮮葉中TCC為（12.25±0.17）%。在加工過程中，TCC含量在萎凋過程中保持不變。做青加工過程中TCC大大減少，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（10.05±0.36）%；殺青過程中含量又略有增加，是由于兒茶素單體EGC、GC和GCG含量的增加導(dǎo)致；干燥后，TCC為（11.06±0.45）%，大約是鮮葉中的90%。

兒茶素含有兩個(gè)芳香環(huán)和幾個(gè)羥基，可分為兩類：游離兒茶素和酯型兒茶素。C、EC、GC和EGC為非酯型，而酯型兒茶素為CG、ECG、GCG和EGCG。此外，兒茶素可根據(jù)其立體化學(xué)構(gòu)型分為“非表兒茶素或非表兒茶素結(jié)構(gòu)”（如C、CG、GC、GCG）和“表兒茶素或表兒茶素結(jié)構(gòu)”（包括EC、ECG、EGC、EGCG）。表兒茶素可以轉(zhuǎn)化為非表兒茶素GC、GCG、CG和C，這被稱為兒茶素的異構(gòu)化，兒茶素的異構(gòu)化是可逆的。表兒茶素和非表兒茶素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中僅在2R、3R（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）和2S、3R（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)）之間存在差異[30-31]。

C的結(jié)構(gòu)與EC相似，但與EC不同的是它有2S、3R結(jié)構(gòu)（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而EC有2R、3R結(jié)構(gòu)（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。鮮葉中EC和C質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（1.92±0.14）%和（1.66±0.17）%。在萎凋的步驟質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持不變，干燥步驟后分別穩(wěn)步下降到（0.84±0.11）%和（0.95±0.17）%。EC和C含量的做青和干燥步驟均有明顯的下降，EC含量分別下降為鮮葉含量的81%和43%，C含量分別下降為鮮葉含量的89%和57%。

EGC和EC具有相似的結(jié)構(gòu)，但EGC與EC的不同之處在于其碳3’,4’,5’在B環(huán)上。GC具有與EGC相同的結(jié)構(gòu)，但與EGC不同的是它有2S、3R（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而EGC有2R、3R（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。研究結(jié)果表明，鮮葉中EGC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.90±0.24）%。EGC含量在萎凋中保持恒定，在做青階段顯著降低，在殺青過程中顯著增加，在干燥過程中顯著增加。做青步驟EGC含量減少到約為鮮葉中的81%，這可能是因?yàn)樵诓糠职l(fā)酵過程中酶的氧化作用。而兩個(gè)熱加工過程（殺青和干燥步驟）顯著增加了EGC含量，在熱加工過程中EGC的增加可能是由于EGCG的熱降解。EGCG可能降低，導(dǎo)致EGC的形成和游離態(tài)G的釋放。鮮葉中GC只含微量，為（0.37±0.04）%。加工過程中GC含量的變化和其表位結(jié)構(gòu)EGC一致。許多研究表明，兒茶素在茶葉生產(chǎn)、釀造和貯存過程中轉(zhuǎn)化為其異構(gòu)體，在高溫環(huán)境下會(huì)發(fā)生異構(gòu)化[30]。研究表明，兒茶素在熱水溶液中處于C2位置時(shí)發(fā)生表面聚合，這種外顯作用可使表兒茶素變?yōu)榉潜斫Y(jié)構(gòu)兒茶素，反之亦然[30,33-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，GC含量的增加，可能是熱加工過程中EGC的異構(gòu)化導(dǎo)致GC含量增加。

ECG與EC具有相似的結(jié)構(gòu)，但ECG在碳環(huán)C3處的沒食子結(jié)構(gòu)不同。CG與ECG結(jié)構(gòu)相同，但與EGC不同的是，它有2S、3R（2,3-trans，非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而ECG有2R、3R（2,3-cis表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。鮮葉和烏龍茶中ECG質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（1.16±0.08）%、（0.71±0.04）%。單因素方差分析表明，ECG在做青過程首次略有下降，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.02±0.29）%；殺青步驟后稍微增加，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.19±0.45）%；在揉捻和干燥過程中均有明顯下降。結(jié)果表明，做青、揉捻和干燥步驟使ECG含量降低，分別約為鮮葉含量的88%、72%和61%。ECG含量波動(dòng)的原因可能是加工過程中的許多因素和反應(yīng)。在做青過程中，ECG可能經(jīng)歷部分發(fā)酵導(dǎo)致ECG發(fā)生酶促氧化，形成二聚體或高度絡(luò)合的化合物群。在熱加工過程中，ECG可能會(huì)發(fā)生降解，導(dǎo)致游離態(tài)G的釋放。此外，ECG可能是由EGCG的熱降解形成。本研究未在鮮葉中檢測(cè)到CG，ECG上的異構(gòu)化作用不能增加CG含量，說明異構(gòu)化作用可能不會(huì)導(dǎo)致ECG的下降。因此，可以合理地得出結(jié)論，在烏龍茶加工過程中，茶葉中的ECG變化相當(dāng)復(fù)雜，但這種變化并非來自異構(gòu)化作用。

EGCG具有與EGC相似的結(jié)構(gòu)，但EGCG與EGC不同的是，在C環(huán)碳3上的EGCG的沒食子酸酯部分與EGC不同。GCG與EGCG具有相同的結(jié)構(gòu)，但與EGCG不同的是，EGCG有一個(gè)2S、3R（2,3-trans、非表兒茶素結(jié)構(gòu)），而EGCG有2R、3R（2,3-cis、表兒茶素結(jié)構(gòu)）[32]。EGCG是鮮葉中含量最多的的酯型兒茶素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（4.94±0.28）%。在加工過程中，EGCG含量在做青過程中顯著降低，并一直保持恒定，直至揉捻為止，干燥過程中其含量再次顯著降低。結(jié)果表明，做青和干燥步驟顯著影響EGCG含量，分別使其下降為鮮葉中含量的80%和61%?？梢缘弥瑸觚埐璧募庸?duì)EGCG的穩(wěn)定性有很大影響，可能是EGCG在做青過程中，在濕度充足的環(huán)境下非常敏感發(fā)生了氧化作用。在做青過程中，EGCG損失的另一個(gè)原因可能是酶氧化，形成二聚兒茶酚和復(fù)合酚類化合物。在熱加工過程中，EGCG損失的主要原因可能是在干燥的過程中，在極高溫度下，會(huì)發(fā)生異構(gòu)化和降解作用。這與之前報(bào)道的EGCG化學(xué)特征的理論理解是一致的[36]。EGCG是一種酯型多酚化合物，在這種條件下，EGCG可氧化成二聚體，降解成EGC和異構(gòu)化作用成GCG[30,34-35]。

GCG在鮮葉中微量，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.26±0.03）%。在做青時(shí)，GCG顯著降低，在殺青階段則又顯著增加，在干燥過程中，它再次顯著增加，干燥步驟之后，GCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到（0.95±0.06）%，變化趨勢(shì)與EGCG相同。

2.3 加工工藝對(duì)酚類化合物含量變化的影響

鮮葉采摘后，在陽光直射下萎凋。與鮮葉相比，凋萎步驟中茶葉兒茶素的含量保持不變，這表明萎凋步驟不影響兒茶素的含量。研究表明，此步驟僅用于鮮葉中去除水分和散發(fā)青草味。在做青過程中，TCC、EC、C、EGC、GC、ECG、EGCG、GCG含量均有所下降。導(dǎo)致兒茶素顯著減少的一個(gè)原因可能是酶促氧化，形成二聚兒茶素和復(fù)合酚化合物。

在殺青、揉捻和干燥加工過程中，兒茶素經(jīng)氧化、水解、聚合和轉(zhuǎn)化后，兒茶素含量降低。結(jié)果表明，殺青和烘干均能顯著提高EGC、GC、GCG的含量。從表1可以看出，烏龍茶中EGC、GC和GCG的含量比鮮葉中超過100%，這表明其他的兒茶素在殺青和干燥過程中會(huì)被轉(zhuǎn)化為EGC、GC和GCG。在熱加工過程中EGC的增加可能是由于EGCG的熱降解，導(dǎo)致EGC的形成和游離態(tài)G的釋放[30]。由于EGCG在熱加工過程中呈下降趨勢(shì)，EGCG的降解較為明顯。EGC和EGCG的異構(gòu)化作用可能會(huì)導(dǎo)致GC和GCG的增加，因?yàn)楫悩?gòu)化會(huì)在高溫下發(fā)生[30]，這種異構(gòu)化作用可使表兒茶素變?yōu)榉潜韮翰杷亍＿@一事實(shí)可以通過前面研究得到支持，研究發(fā)現(xiàn)，EGCG生成的GCG進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物或自由基，甚至無法被檢測(cè)到[37]。雖然異構(gòu)化可以將表兒茶素轉(zhuǎn)化為非表兒茶素，反之亦然，但隨著EGCG含量的降低，GCG的含量升高，這可能是由于EGCG含量高于GCG，EGCG的轉(zhuǎn)化程度大于GCG。因此，EGCG含量與GCG含量趨于平衡，兒茶素的異構(gòu)化作用，尤其是EGCG，被認(rèn)為是烏龍茶生產(chǎn)中最重要的反應(yīng)之一[30,33-35]。此外，導(dǎo)致兒茶素變化的其他原因可能是加工過程中可用的氧和金屬離子，高氧水平會(huì)增加兒茶素氧化，兒茶素能與金屬離子反應(yīng)形成金屬絡(luò)合物，且金屬離子優(yōu)先與ECG和EGCG的基團(tuán)結(jié)合[38-39]。

3 結(jié) 論

結(jié)果表明，在烏龍茶生產(chǎn)過程中，兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，約為10%。兒茶素單體變化不一，其中EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為鮮葉的43%，C質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為鮮葉的57%，EGC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加為鮮葉的1.67 倍，GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加為鮮葉的4 倍，ECG和EGCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低約為鮮葉的61%，GCG質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加為鮮葉的3.65 倍。

在加工過程中，做青、殺青和干燥步驟對(duì)兒茶素含量有影響。兒茶素單體的變化可能是由于酶的氧化、熱降解和異構(gòu)化。由于人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到茶葉中含有的生物活性多酚類化合物對(duì)健康的潛在益處，茶葉市場(chǎng)得到了廣泛的發(fā)展。因此，本研究的結(jié)果為茶葉產(chǎn)業(yè)提供了酚類化合物的確切信息。