穆婉菊，馮 佳，李秀秀，李書紅,2，陳 野,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2.天津科技大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

菊粉存在于洋姜和菊苣中，主要作為一種儲存碳水化合物，可以成為人類日常飲食的一部分[1-2]。菊粉是由D-呋喃果糖分子以β-(2→1)糖苷鍵連接而成的末端有一個葡萄糖殘基的果聚糖，聚合度通常為2～60。根據(jù)聚合度不同，可以將菊粉分為長鏈菊粉、天然菊粉和短鏈菊粉[3]。菊粉具有多種生理功能，如改善腸道微環(huán)境、控制血脂、低熱量控制體質(zhì)量、促進礦物質(zhì)吸收、促進維生素合成、調(diào)節(jié)血糖水平和抗癌效果等[4-6]。由于其良好的生理功能和理化性質(zhì)，菊粉常被用作一種益生元、脂肪替代品、糖替代品、質(zhì)地修飾劑以及功能性食品，可以改善人體健康狀況[7-8]。

目前，在面粉工業(yè)中，各種膳食纖維，如大豆纖維、麥麩纖維、米糠纖維、燕麥纖維、殼聚糖纖維和果蔬纖維等已被應(yīng)用于面包、餅干、蛋糕、饅頭和面條中[9-10]。然而，限制膳食纖維在面粉中被廣泛應(yīng)用的最主要原因是這類常見的膳食纖維絕大多數(shù)水溶性低，粒徑粗大，色澤和食品加工性能差，即使低添加量也會給最終產(chǎn)品品質(zhì)帶來嚴重的不良影響，尤其是在口感、色澤和質(zhì)構(gòu)特性等方面[4]。與傳統(tǒng)的膳食纖維相比，菊粉在面制品中的應(yīng)用具有自身的優(yōu)勢。目前，將菊粉應(yīng)用于面制品中的基礎(chǔ)性研究鮮有報道。面筋蛋白作為面制品中的重要組分，通過對其性質(zhì)的基礎(chǔ)性研究可以更好地了解菊粉對面制品品質(zhì)的影響。

小麥面筋蛋白是從小麥面粉中經(jīng)過分離、提取和干燥得到，其含蛋白質(zhì)高達80%以上[5]。小麥面筋蛋白主要由麥谷蛋白和醇溶蛋白組成，麥谷蛋白與面筋彈性有關(guān)，而醇溶蛋白與面筋的黏性有關(guān)[13-15]。小麥面筋蛋白的質(zhì)量影響著小麥面團黏彈性和加工品質(zhì)，因此對其性質(zhì)的研究具有十分重要的意義[6]。本研究將菊粉加入到小麥面筋蛋白中，對面筋蛋白乳化特性、熱特性和結(jié)構(gòu)特性進行研究并對其性質(zhì)變化與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進行深入探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然菊粉（純度＞90%） 重慶驕王天然產(chǎn)物股份有限公司；面筋蛋白 鄭州市豫香食品發(fā)展有限公司。

三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸（均為分析純） 天津市北方天醫(yī)化學試劑廠。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；FD-10冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；DSC-60A差示掃描量熱儀 日本島津有限公司；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀、JSM-IT300LV掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 菊粉和小麥面筋蛋白復合物的制備

每個樣品干質(zhì)量為10 g，將不同質(zhì)量的菊粉充分溶解于20 mL蒸餾水中，加入面筋蛋白分散于溶液中，使得菊粉添加量分別為0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%和20%。混合物在40 ℃保溫2 h，以此來模擬在面團中的反應(yīng)。反應(yīng)充分的混合物進行冷凍干燥處理24 h，取出后研磨成粉末，過100 目篩。

1.3.2 蛋白質(zhì)乳化特性的測定

取0.5 g樣品分散于20 mL蒸餾水中，振蕩30 min，4 000 r/min離心15 min。取上清液15 mL加入大豆油5 mL，高速剪切10 000 r/min均質(zhì)1 min。制備好的乳狀液分別于0 min和10 min時從乳液底部吸取500 μL，加入到5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉溶液中，混合均勻后用紫外-可見分光光度計在波長500 nm處測定吸光度A0和A10，以0.1%十二烷基硫酸鈉溶液作為對照。乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別按式（1）、（2）計算：

式中：N為稀釋倍數(shù)；θ為油相體積/mL；L為比杯厚度/cm；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.3 蛋白質(zhì)熱力學特性分析

采用差示掃描量熱法對不同菊粉添加量的小麥面筋蛋白進行熱力學特性分析。稱取3 g左右的樣品放入固體坩堝中，以空坩堝作為對照，放入差示掃描量熱儀進行測量。所有測量過程都以10 ℃/min的速率進行加熱，從30 ℃升溫至160 ℃，均重復進行3 次。

1.3.4 蛋白質(zhì)巰基及二硫鍵的測定

溶液的配制：磷酸鹽緩沖液：取4 g NaCl、0.1 g KCl、0.71 g Na2HPO4和0.135 g NaH2PO4充分溶解于蒸餾水中，并將其定容至500 mL，pH值為7.4。Tris-Gly-Urea緩沖液：取5.209 g三羥甲基氨基甲烷、3.378 g甘氨酸、0.7445 g乙二胺四乙酸二鈉和240.24 g尿素充分溶解于蒸餾水中，并將其定容至500 mL，pH值為8.0。Tris-Gly緩沖液：取10.418 g三羥甲基氨基甲烷、6.756 g甘氨酸和1.489 g乙二胺四乙酸二鈉充分溶解于蒸餾水中，并將其定容至1 000 mL，pH值為8.0。Ellman試劑：將20 mg DTNB溶解于5 mL Tris-Gly緩沖液中。

自由巰基的測定：將60 mg樣品分散于1 mL磷酸鹽緩沖液中，向混合體系中加入5 mL Tris-Gly-Urea緩沖液后充分振蕩，再加入50 μL Ellman試劑后避光靜置1 h，隨后3 000 r/min離心10 min。取上清液用紫外分光光度計在波長412 nm處測量吸光度（A412nm）。按式（3）計算自由巰基含量：

式中：7 3.5 3為E l l m a n試劑的摩爾消光系數(shù)/（mol/mL）；D為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

總巰基測定：即稱取樣品120 mg分散于2 mL磷酸鹽緩沖溶液中，加入4 μLβ-巰基乙醇處理2 h后，加入4 mL 12%三氯乙酸溶液靜置1 h后，10 000 r/min離心20 min。用12%三氯乙酸溶液洗滌沉淀3 次，每次洗滌后10 000 r/min離心10 min。去除上清液，加入2 mL Tris-Gly緩沖液和80 μL Ellman試劑，進行劇烈振蕩后25 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心30 min。以不加Ellman試劑為對照，取上清液稀釋10 倍后測定波長412 nm處吸光度。總巰基含量計算同式（3），并按式（4）進行二硫鍵含量計算：

1.3.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析，準確稱量1 mg樣品，將150 mg溴化鉀與樣品混合，充分研磨使其混合均勻。隨后混合物被壓縮并放置在紅外分析儀上，以4 cm－1的分辨率記錄紅外光譜，掃描次數(shù)為16 次。所有測量均重復進行3 次。

傅里葉變換紅外光譜圖的處理：利用軟件OMNIC 8.0進行分析，首先進行基線校正，然后傅里葉自去卷積，選擇合適的峰寬（24～26）和增強度（2.9～3.1），進行高斯函數(shù)找峰，擬合峰處理直至峰特征穩(wěn)定，確定各子峰與各二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系，計算各子峰面積的相對含量。

1.3.6 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析

使用掃描電子顯微鏡觀察蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。將冷凍干燥后的樣品破碎，使用雙面膠將蛋白凍干樣的斷面朝上，固定在樣品臺上，使用濺射涂布機對樣品的斷面進行噴金處理使樣品導電，觀察斷面的微觀結(jié)構(gòu)。放大倍數(shù)為150 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖；采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性分析和方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉添加量對小麥面筋蛋白乳化特性的影響

圖1 菊粉添加量對蛋白質(zhì)乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig. 1 Effects of inulin on emulsifying activity index (A) and emulsion stability index (B) of wheat gluten protein

小麥蛋白的乳化活性與面制品的柔軟度有關(guān)，蛋白質(zhì)的乳化活性越大，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，因此乳化活性可影響最終面制品的口感[7]。如圖1A所示，菊粉的添加顯著增加了蛋白質(zhì)的乳化活性，這是由于菊粉有較強吸水性，改變了蛋白質(zhì)內(nèi)部水分分布，破壞了蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力，促進蛋白質(zhì)中疏水基團相互作用，使蛋白質(zhì)乳化活性增強。另一方面，菊粉的添加可以加強蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈基團與水相互作用，使蛋白質(zhì)溶解度增加，從而使乳化活性增強。當菊粉添加量低于10.0%時，隨著菊粉添加量的增加，蛋白質(zhì)乳化活性升高，提高14.4%。當菊粉添加量繼續(xù)增大，即菊粉添加量超過10%時，菊粉吸水能力達到飽和，對蛋白質(zhì)溶解度的影響很小，因此對乳化活性影響也較小。

如圖1B所示，與乳化活性結(jié)果類似，低添加量菊粉對乳化穩(wěn)定性的影響較為顯著，尤其當菊粉添加量為7.5%時，蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性提高了18.7%。有研究表明菊粉可提高麥醇溶蛋白的乳化穩(wěn)定性但是會降低麥谷蛋白的乳化穩(wěn)定性，但菊粉對小麥蛋白乳化穩(wěn)定性的影響中麥醇溶蛋白起主導作用[8]。本研究得到相同的結(jié)果，菊粉可提高小麥蛋白的乳化穩(wěn)定性，此作用尤其在菊粉添加量較低時更為明顯。

2.2 菊粉添加量對小麥面筋蛋白熱力學特性的影響

表1 菊粉添加量對小麥蛋白熱力學特性的影響Table 1 Effect of inulin on thermodynamic property of wheat gluten protein

蛋白質(zhì)變性過程中會涉及吸熱反應(yīng)和放熱反應(yīng)，焓變值代表反應(yīng)過程中吸放熱情況，焓變值的大小決定蛋白質(zhì)變性的程度，而變性溫度可以反映小麥蛋白的熱穩(wěn)定性[9]。如表1所示，純小麥蛋白的熱變性溫度為79.32 ℃，隨著菊粉添加量的增加，小麥蛋白的熱變性溫度升高，當添加量為12.5%時達到最大值，變性溫度為（90.29±1.17）℃。這說明添加菊粉可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，可能是由于菊粉側(cè)鏈大量羥基，與蛋白質(zhì)的親油基團通過氫鍵作用形成緊密的結(jié)構(gòu)造成的。有研究也得到多糖可以改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的相關(guān)結(jié)論[10]。

小麥蛋白的焓變值在添加菊粉時逐漸下降，但當菊粉添加量較低時，焓變值的變化并不顯著，當添加量為12.5%時，焓變值顯著降低。本實驗中菊粉加入到蛋白質(zhì)中進行熱處理，導致美拉德交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，最終使焓變值降低。

2.3 小麥面筋蛋白巰基及二硫鍵含量測定

二硫鍵可使蛋白質(zhì)肽鏈空間結(jié)構(gòu)更加緊密，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，相反，二硫鍵斷開會造成蛋白質(zhì)黏度下降，影響食品加工過程中面制品的品質(zhì)[21-22]。蛋白質(zhì)中的二硫鍵可以經(jīng)過還原反應(yīng)形成巰基后，蛋白質(zhì)構(gòu)象將變得松散，但在一定條件下自由巰基經(jīng)重新氧化，又可重新形成二硫鍵，二硫鍵可按照原來的配對進行組合，這樣形成的蛋白質(zhì)可與天然蛋白質(zhì)一樣，既有正確的空間構(gòu)象，又具有原來蛋白質(zhì)的生物活性。

表2 菊粉添加量對小麥蛋白自由巰基及二硫鍵含量的影響Table 2 Effect of inulin on disulfide and free sulfhydryl contents of wheat gluten protein

如表2所示，隨著菊粉添加量的增加，蛋白質(zhì)自由巰基含量下降，二硫鍵含量增加，當菊粉添加量達到20%時，蛋白質(zhì)自由巰基含量下降了67.73%，二硫鍵含量增加了2.22 倍，這些變化都表明自由巰基正逐步向二硫鍵結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。在滿足二硫鍵形成的化學條件下，二硫鍵的形成原本是一個隨機的過程，但菊粉的加入可能會加大這種隨機事件的概率，導致蛋白質(zhì)二硫鍵進一步形成。菊粉應(yīng)用于面制品加工中，可對面團柔韌性有積極影響。

2.4 菊粉添加量對小麥面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是由多種力共同維持的，其中最重要的作用力是氫鍵，傅里葉變換紅外光譜對氫鍵強度十分敏感，因此常作為分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法[11]。傅里葉變換紅外光譜圖中酰胺I帶不同的吸收波數(shù)分別對應(yīng)著蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)（1 650～1 660 cm－1）、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（1 660～1 700 cm－1）、β-折疊結(jié)構(gòu)（1 610～1 640 cm－1）和無規(guī)卷曲（1 640～1 650 cm－1）[12]。

小麥蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)是一個穩(wěn)定牢固的彈性結(jié)構(gòu)，它與面制品的品質(zhì)有關(guān)，主要影響面團的彈性和硬度[13]。如表3所示，添加菊粉對小麥蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量影響不顯著。隨著菊粉添加量增加，小麥蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲相對含量升高，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量降低。由于菊粉強大的吸水性，導致整個體系中自由水減少，這種水合環(huán)境的改變最直接的結(jié)果就是導致維持β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氫鍵被破壞，使β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例降低。同時，菊粉的存在還使一些小分子蛋白在非共價相互作用下發(fā)生聚集，導致β-折疊結(jié)構(gòu)增多。有研究也得出相似結(jié)論，新形成的β-折疊結(jié)構(gòu)屬于反平行β-折疊結(jié)構(gòu)[14]。由于菊粉可以與水分子形成氫鍵，使得體系中水分結(jié)合的更加緊密，進而使C＝O與水形成的氫鍵增強，小麥蛋白中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例也隨之增加[15]。

表3 菊粉添加量對小麥蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of inulin on secondary structures of wheat gluten protein

2.5 菊粉添加量對小麥面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖2 菊粉添加量對蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of inulin on microstructure of wheat gluen protein

從圖2可以看出，不添加菊粉的小麥蛋白結(jié)構(gòu)存在孔隙，隨著菊粉的加入，孔隙逐漸消失，結(jié)構(gòu)逐漸致密。添加菊粉后的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與蛋白質(zhì)乳化活性增強有關(guān)，菊粉的添加使面筋蛋白中麥醇溶蛋白親水作用增強，這使面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到強化?？梢杂^察到添加10%菊粉的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最致密，這與菊粉添加量為10%時，蛋白質(zhì)乳化活性較強的實驗結(jié)果相一致。另外，面筋蛋白中二硫鍵含量的增加也是造成面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固的原因。

當菊粉添加量達到7.5%時，可以觀察到菊粉附著到面筋蛋白表面上，隨著菊粉添加量進一步增加，覆蓋程度也進一步加強。當菊粉添加量達到20%時，顯微圖像中已經(jīng)基本觀察不到孔隙的存在。菊粉與蛋白質(zhì)間存在著氫鍵和疏水鍵，這些局部作用力在2 種物質(zhì)邊界處起到連接作用[16]。菊粉和某些蛋白質(zhì)如酪蛋白和β-乳球蛋白的疏水作用還可在溶液中形成一個具有疏水中心的螺旋旋渦，這也可能對蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響[29-30]。

3 結(jié) 論

本實驗研究了不同菊粉添加量對小麥蛋白多種理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。菊粉可改善小麥蛋白乳化性能，較低添加量的菊粉對小麥蛋白乳化性能的影響較顯著；小麥蛋白的熱變性溫度在添加菊粉之后升高，焓變值降低，在一定程度上說明菊粉可以提高小麥蛋白熱穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)中自由巰基與二硫鍵之間可通過一系列氧化還原反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化，隨著菊粉添加量的增加，蛋白質(zhì)中自由巰基逐步向二硫鍵結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，這使得蛋白分子空間結(jié)構(gòu)更加緊密；對于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)而言，菊粉對小麥蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例影響不顯著，但會使蛋白結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲所占比例升高，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對含量比降低；對于蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)而言，菊粉使蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密和穩(wěn)定。總之，菊粉可以改善蛋白質(zhì)多種理化性質(zhì)，此研究為后續(xù)菊粉作為一種膳食纖維添加到面制品的研究中提供了理論支持。