王 穎，李 欣，李 錚，朱 杰*，張社奇，張德權(quán),*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院生物物理研究所，生物力學(xué)與工程研究室，陜西 楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

肌聯(lián)蛋白是骨骼肌的肌原纖維細(xì)絲的重要組成部分，是含量第三的肌原纖維蛋白，約占肌原纖維蛋白總量的8%～12%，含量僅次于肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，其分子質(zhì)量最大，約3 700 kDa[1]。肌聯(lián)蛋白序列包括近端免疫球蛋白區(qū)域、獨(dú)特序列區(qū)域、免疫球蛋白區(qū)域和獨(dú)特區(qū)域交替出現(xiàn)區(qū)域（N2區(qū)域）、激酶區(qū)域、PEVK區(qū)域（富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、纈氨酸（V）和賴氨酸（K））和免疫球蛋白重復(fù)區(qū)域。該蛋白的C端起于M線，N端終止于Z線，橫跨肌小節(jié)一半，維系著整個(gè)肌原纖維結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性[2-3]。肌聯(lián)蛋白的降解引起Z線結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致肌原纖維小片化。肌原纖維小片化釋放僵直時(shí)肌肉收縮所形成的張力，是解僵和肉嫩度增加的原因[4]。肌聯(lián)蛋白降解能夠促進(jìn)宰后肉嫩化進(jìn)程，提高肉嫩度。

近年來，隨著磷酸化蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)磷酸化成為肉品科學(xué)的研究熱點(diǎn)[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)在宰后肉嫩化過程中，肌聯(lián)蛋白發(fā)生磷酸化反應(yīng)[6-7]。Wang Ying等[8]研究表明腰大肌中肌聯(lián)蛋白降解速率快，其磷酸化水平高于背最長肌和半膜肌中的磷酸化水平（P＜0.05）。但肌聯(lián)蛋白降解是否受磷酸化影響進(jìn)而促進(jìn)宰后肉嫩化進(jìn)程尚不清楚。本研究以羊背最長肌為原料，提取肌聯(lián)蛋白，通過蛋白激酶A與堿性磷酸酶分別催化肌聯(lián)蛋白發(fā)生磷酸化及去磷酸化反應(yīng)，研究磷酸化對(duì)肌聯(lián)蛋白降解速率的影響，進(jìn)一步闡明磷酸化調(diào)控肌聯(lián)蛋白降解機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取體質(zhì)量相近、飼養(yǎng)方法相同的小尾寒羊公羊5 只。平均胴體質(zhì)量（18±1）kg。宰后30 min內(nèi)取羊右側(cè)背最長肌，分裝至凍存管中，液氮速凍并放置－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

蛋白激酶A（P2645）、堿性磷酸酶（P0114）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E-64）、亮抑酶肽、咪唑、溴酚藍(lán)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、過硫酸銨（ammonium persulfate，APS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國Sigma公司；蛋白濃度測定試劑盒 美國Pierce Chemical公司；Pro-Q Diomond染色液和SYPRO Ruby染色液 美國Invitrogen公司；氯化鉀、碳酸氫鈉、磷酸鉀、氯化鎂、氫氧化鈉（均為優(yōu)級(jí)純） 上海阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MSC-100恒溫振蕩金屬浴 杭州奧盛儀器有限公司；Mettler Toledo pH計(jì) 瑞士FE20公司；ML204/02電子天平上海梅特勒-托利多有限公司；Ultra Turrax Disperser S25勻漿機(jī) 德國IKA公司；Himac CR 22 GII高效冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；SpectraMax 190全波長酶標(biāo)儀美國Molecular Devices公司；D37520小型離心機(jī)德國Sigma公司；TS-2型水平脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電泳設(shè)備（Mini-PROTEAN Tetra System）、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)、SuperoseTM6 Increase 10/300GL凝膠柱 美國GE公司；Multimode-8原子力顯微鏡 美國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 肌聯(lián)蛋白粗提取

參考Soteriou等[9]的方法，并稍作修改。整個(gè)提取過程在4 ℃進(jìn)行。取10 g肉樣，加入30 mL預(yù)冷緩沖溶液A（50 mmol/L KCl、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L E-64、1 mmol/L NaHCO3，pH 6.8），勻漿3 次（每次30 s，中間間隔15 s）。每次勻漿后2 000×g離心5 min。3 次離心后，棄上清液。沉淀中加入2 倍體積的緩沖液B（0.9 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 咪唑、2 mmol/L EGTA、40 μg/mL亮抑酶肽、0.5 mmol/L DTT、5 mmol/L E-64，pH 6.8）將沉淀懸浮，攪拌提取5 min，期間溶液進(jìn)行冰浴，留取該階段的蛋白樣品。之后20 000×g離心30 min，棄沉淀，將上清液中加入超純水稀釋3 倍（離子強(qiáng)度約為0.2 mol/L），冰浴1 h后，20 000×g離心30 min，去除沉淀的肌球蛋白。上清液使用超純水稀釋5 倍（離子強(qiáng)度約為0.05 mol/L），靜止40 min，11 000×g離心30 min，棄上清液。將沉淀溶解在緩沖液C（0.6 mol/L KCl、30 mmol/L K3PO4，pH 6.8）中。

1.3.2 肌聯(lián)蛋白純化

取上述蛋白溶液（質(zhì)量濃度為33 μg/μL）1.5 mL上樣于用緩沖液C平衡的SuperoseTM6 Increase 10/300GL凝膠過濾柱，在色譜出現(xiàn)第1個(gè)峰處收集蛋白組分，得到肌聯(lián)蛋白粗提物。具體操作如下：1）處理流動(dòng)相：使用0.45 μm水系膜進(jìn)行過濾，并使用超聲波排除溶液中氣泡防止堵塞凝膠柱；2）平衡凝膠柱：流速設(shè)定參數(shù)為0.5 mL/min，壓強(qiáng)2 MPa，波長280 nm，平衡一個(gè)柱體（48 min）；3）上樣：體積為1.5 mL。

1.3.3 粗提肌聯(lián)蛋白的原子力顯微鏡掃描

為確證肌聯(lián)蛋白的存在，肌聯(lián)蛋白粗提物使用原子力顯微鏡掃描。10 μL的肌聯(lián)蛋白粗提物滴在新的云母片上，室溫放置30 min。期間，使用超純水緩慢清洗云母片3 次，洗去鹽離子。待云母片晾干后，使用原子力顯微鏡進(jìn)行掃描。原子力顯微鏡采集樣品表面信息通過一端裝有探針的三角形硅尖微懸臂完成。其中懸臂為氮化硅材質(zhì)，彈性系數(shù)為0.4 N/m。當(dāng)針尖與樣品接近時(shí)，此原子力顯微鏡可以通過ScanAsyst智能成像模式，對(duì)樣品進(jìn)行圖像采集。薄片用雙面膠帶固定在AFM金屬圓盤上[10]。掃描速度為1 Hz，像素為512×512。同時(shí)采集高度和誤差圖像。使用離線軟件NanoScope Analysis V1.80對(duì)圖像進(jìn)行平化、擦除和分析[11]。

1.3.4 體外孵育

將肌聯(lián)蛋白粗提物，使用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)量濃度調(diào)制20 μg/μL后進(jìn)行體外孵育。體外孵育的操作參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[12-13]，并稍作調(diào)整。配制蛋白激酶A溶解液（10 mmol/L MgCl2、20 mmol/L DTT）和ATP溶液（500 mmol/L ATP，其中含有10 mmol/L MgCl2），且使用緩沖液C定容。將所得的蛋白溶液均分為3 份，每組蛋白為600 μL，分別為蛋白激酶A組、對(duì)照組和堿性磷酸酶組。其中蛋白激酶A組：添加1 mL蛋白激酶A（1 U/10 μg蛋白）、480 μL ATP溶液；堿性磷酸酶組：添加24 μL堿性磷酸酶（1 U/4 μg蛋白）、480 μL ATP溶液；對(duì)照組：添加480 μL ATP溶液，統(tǒng)一調(diào)整pH值至6.8，3 組分別使用緩沖液C調(diào)至相同體積（3 mL），在30 ℃振蕩孵育30 min。

每組樣品分為2 份，設(shè)定的孵育體系為500 μL。其中400 μL蛋白溶液、60 μL μ-鈣蛋白酶（1 U/10 μg）和40 μL氯化鈣溶液。其中設(shè)定的鈣離子濃度參照Du Manting等[14]的實(shí)驗(yàn)方法，并稍作修改。 分別設(shè)定濃度為0.05 mmol/L（25 μL1 mmol/L氯化鈣溶液和15 μL超純水）和2 mmol/L（10 μL 100 mmol/L氯化鈣溶液和30 μL超純水），在4 ℃進(jìn)行振蕩孵育。在孵育0.5 h、12 h、1 d和2 d時(shí)，分別取70 μL的蛋白樣品，和相同體積的上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10 mmol/L DTT、40 g /L SDS、1 g/L溴酚藍(lán)、250 g/L甘油）混合，在沸水中煮沸3 min，分裝后保存于－20 ℃，用于測定肌聯(lián)蛋白磷酸化水平及其降解情況。

1.3.5 pH值測定

在孵育前后，使用pH計(jì)測定孵育體系pH值，測定3次取平均值。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、熒光染色及圖像分析

肌聯(lián)蛋白磷酸化水平及其降解程度參照Wang Ying等[8]的實(shí)驗(yàn)方法。蛋白上樣量為30 μg，分離膠為5%，一塊凝膠的配制方法如下：2.84 mL超純水、1.25 mL 1.5 mol/L Tris-HCl、50 μL 10% SDS、0.875 mL丙烯酰胺（甲叉丙烯酰胺-雙甲叉丙烯酰胺，37.5∶1，m/m）、2.5 μL TEMED和25 μL 10% APS；濃縮膠為4%，一塊凝膠的配制方法如下：1.525 mL超純水、0.625 mL 1.5 mol/L Tris-HCl、25 μL 10% SDS、0.325 mL丙烯酰胺（甲叉丙烯酰胺-雙甲叉丙烯酰胺，37.5∶1，m/m）、5 μL TEMED和12.5 μL 10% APS。電泳完成后，凝膠分別進(jìn)行Pro-Q染色和SYPRO Ruby染色。2 次分別使用ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)掃描得到凝膠圖片。

凝膠使用Pro-Q染色得到磷酸化蛋白條帶，Ruby染色得到的是與之相對(duì)應(yīng)的全蛋白條帶。凝膠圖像分別使用Quanlity One 4.6.2軟件分析。肌聯(lián)蛋白磷酸化水平為Pro-Q染色的肌聯(lián)蛋白灰度值與Ruby染色的肌聯(lián)蛋白灰度值的比值（P/T）。其中蛋白Marker作為電泳過程中的標(biāo)準(zhǔn)樣品。肌聯(lián)蛋白相對(duì)磷酸化水平為兩者比值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

孵育前后的pH值和肌聯(lián)蛋白相對(duì)磷酸化水平均采用單因素方差分析，選擇多重比較方法，通過最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。數(shù)據(jù)表示為。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌聯(lián)蛋白柱層析純化及SDS-PAGE檢測結(jié)果

肌原纖維蛋白溶液上樣于SuperoseTM6 Increase 10/300GL后，得到一系列蛋白洗脫峰，如圖1所示。肌聯(lián)蛋白是骨骼肌中分子質(zhì)量最大的肌原纖維蛋白，約3 700 kDa，為T1[2-3]。肌聯(lián)蛋白T1有2 個(gè)降解產(chǎn)物，即T2（約2 400 kDa）和約為1 200 kDa的降解產(chǎn)物[15-16]。當(dāng)色譜圖中出現(xiàn)第1個(gè)蛋白洗脫峰時(shí)收集蛋白組分，此組分中應(yīng)該含有肌聯(lián)蛋白。將提取過程中的肌原纖維蛋白進(jìn)行單向凝膠電泳，如圖2所示。泳道1為肌原纖維蛋白條帶，該結(jié)果與Wu等[17]研究結(jié)果一致，凝膠圖中能夠檢測出肌聯(lián)蛋白T1和T2條帶。泳道1～4，肌球蛋白重鏈的灰度值明顯降低，說明在提取過程中去除了大量肌球蛋白重鏈。另外，與泳道3相比，泳道4中小于150 kDa的蛋白條帶明顯減少，表明使用凝膠柱過濾后，去除了分子質(zhì)量較小的蛋白，保留了分子質(zhì)量較大蛋白（＞150 kDa）。綜上所述，在第1個(gè)蛋白洗脫峰處收集的蛋白組分含有肌聯(lián)蛋白，可用于孵育實(shí)驗(yàn)。

圖1 羊背最長肌的肌聯(lián)蛋白粗提物SuperoseTM 6 Increase 10/300GL柱層析結(jié)果Fig. 1 SuperoseTM 6 Increase 10/300GL column chromatography of crude titin from ovine longissimus lumborum muscle

圖2 提取過程中一系列蛋白SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE patterns of a series of proteins during the extraction

2.2 肌聯(lián)蛋白粗提物原子力顯微鏡掃描

圖3 肌聯(lián)蛋白粗提物原子力顯微鏡掃描圖Fig. 3 Atomic force microscopic (AFM) images of crude titin

為確證收集的蛋白組分中存在肌聯(lián)蛋白，使用原子力顯微鏡對(duì)肌聯(lián)蛋白粗提物進(jìn)行掃描，得到肌聯(lián)蛋白局部和全部的結(jié)構(gòu)掃描結(jié)果，如圖3所示。肌聯(lián)蛋白粗提物在云母片并非均勻分布，一些呈線型，而一些聚集成團(tuán)狀（圖3A）。在圖3B和圖3C中能夠觀察到肌聯(lián)蛋白在聚集時(shí)的頭部結(jié)構(gòu)，該結(jié)果和Kellermayer等[18]研究結(jié)果一致。但本研究中沒有得到單個(gè)肌聯(lián)蛋白分子結(jié)構(gòu)圖，原因?yàn)橹茦舆^程中，肌聯(lián)蛋白分子的濃度較大使蛋白更易發(fā)生聚集，呈現(xiàn)團(tuán)狀。

2.3 pH值測定結(jié)果

表1 孵育前后pH值的變化情況Table 1 Changes in pH of systems before and after incubation

如表1所示，孵育后，蛋白激酶A組、對(duì)照組和堿性磷酸酶組的pH值均顯著下降（P＜0.05），但孵育前后3 組pH值之間差異不顯著（P＞0.05）。前期研究發(fā)現(xiàn)pH值是影響μ-鈣蛋白酶活性的重要因素[19-21]。本研究孵育后pH值在蛋白激酶A組、對(duì)照組和堿性磷酸酶組中無明顯差異，排除了由pH值不同而引起的3 個(gè)處理組中μ-鈣蛋白酶活性差異的影響。

2.4 肌聯(lián)蛋白磷酸化水平

圖4 孵育后肌聯(lián)蛋白磷酸化水平分析Fig. 4 Gel-based analysis of titin phosphorylation

如圖4所示，蛋白激酶A組中的肌聯(lián)蛋白磷酸化水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），對(duì)照組中肌聯(lián)蛋白磷酸化水平顯著高于堿性磷酸酶組（P＜0.05）。該結(jié)果表明蛋白激酶A和堿性磷酸酶能夠顯著促使肌聯(lián)蛋白發(fā)生磷酸化和去磷酸化。骨骼肌肌聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)包括N2區(qū)域，即免疫球蛋白區(qū)域和獨(dú)特區(qū)域交替出現(xiàn)區(qū)。該區(qū)域在ATP和蛋白激酶A存在條件下可被蛋白激酶A催化發(fā)生磷酸化[22-23]，所以蛋白激酶A組肌聯(lián)蛋白磷酸化水平顯著高于另外2 組（P＜0.05）。另外，堿性磷酸酶組肌聯(lián)蛋白磷酸化水平最低，這是因?yàn)閴A性磷酸酶能夠使肌聯(lián)蛋白發(fā)生去磷酸化。堿性磷酸酶通過水解可以將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，或?qū)⒘姿峄鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至其他含有羥基的醇類[24-25]。本研究中堿性磷酸酶可能不僅抑制了肌聯(lián)蛋白激酶區(qū)域發(fā)生磷酸化，而且促使其他區(qū)域發(fā)生了去磷酸化，故堿性蛋白酶組中肌聯(lián)蛋白磷酸化水平顯著低于另外2 組（P＜0.05）。

2.5 肌聯(lián)蛋白降解情況

如圖5A所示，在鈣離子濃度0.05 mmol/L時(shí)，蛋白激酶A組和對(duì)照組僅檢測到肌聯(lián)蛋白降解條帶T2，而在鈣離子濃度為2 mmol/L時(shí)檢測到2 個(gè)降解條帶，即T2和1 200 kDa條帶。堿性磷酸酶組中，在鈣離子濃度為0.05 mmol/L和2 mmol/L時(shí)，均能檢測到3 個(gè)條帶，但在鈣離子濃度為2 mmol/L時(shí)，1 200 kDa的降解條帶的灰度值明顯較高，這說明提高鈣離子濃度促進(jìn)肌聯(lián)蛋白降解。肌聯(lián)蛋白是μ-鈣蛋白酶的降解底物[17]，而μ-鈣蛋白酶是一種鈣依賴性蛋白酶，需要微摩爾級(jí)的鈣才能激活。隨著鈣離子濃度的增加，能夠促進(jìn)μ-鈣蛋白酶降解而發(fā)揮活性，進(jìn)而促進(jìn)肌聯(lián)蛋白的降解速率[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在鈣離子濃度為0.05 mmol/L時(shí)，3 組均出現(xiàn)T2降解條帶，蛋白激酶A組和對(duì)照組中的肌聯(lián)蛋白降解沒有明顯差異，但AP組中肌聯(lián)蛋白在孵育12 h時(shí)T1較模糊，且出現(xiàn)分子質(zhì)量為1 200 kDa的降解條帶（圖5A）。在鈣離子濃度2 mmol/L時(shí)，蛋白激酶A組、對(duì)照組和堿性磷酸酶組均可以檢測到2 個(gè)降解條帶，即T2和分子質(zhì)量為1 200 kDa的條帶。而堿性磷酸酶組中的1 200 kDa條帶的灰度值明顯高于對(duì)照組和堿性磷酸酶組（圖5B），說明堿性磷酸酶組中的肌聯(lián)蛋白降解程度高，去磷酸化反應(yīng)促進(jìn)肌聯(lián)蛋白降解。前期研究表明肌肉pH值高促進(jìn)肌聯(lián)蛋白降解。Wu[17]和Lomiwes[20]等研究發(fā)現(xiàn)在高極限pH值的肌肉中μ-鈣蛋白酶活性較高，肌聯(lián)蛋白降解迅速。本研究中3 組之間pH值無顯著差異（表1，P＞0.05），說明3 組之間沒有因pH值而引起的酶活不同。本研究中堿性磷酸酶組中肌聯(lián)蛋白磷酸化水平低、降解速率快（圖5），說明去磷酸化促進(jìn)了該蛋白降解。這可能是因?yàn)閴A性磷酸酶使肌聯(lián)蛋白釋放蛋白的磷酸根基團(tuán)或者使其發(fā)生轉(zhuǎn)移引起肌聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而促進(jìn)μ-鈣蛋白酶更易識(shí)別該蛋白，使蛋白更易降解。而去磷酸化促進(jìn)其降解機(jī)理需要通過分析體外狀態(tài)下去磷酸化的肌聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 在鈣離子濃度分別為0.05 mmol/L（A）和2 mmol/L（B）時(shí)3 組的降解情況Fig. 5 Degradation of titin in three groups at Ca2+ concentrations of 0.05 mmol/L (A) and 2 mmol/L (B)

3 結(jié) 論

蛋白激酶A和堿性磷酸酶可促使肌聯(lián)蛋白發(fā)生磷酸化和去磷酸化反應(yīng)。隨著鈣離子濃度的增加，蛋白激酶A組、對(duì)照組和堿性磷酸酶組肌聯(lián)蛋白降解速率加快。相同鈣離子濃度條件下，堿性磷酸酶組中肌聯(lián)蛋白降解較快，表明去磷酸化促進(jìn)肌聯(lián)蛋白發(fā)生降解。