葉衛(wèi)東， 鄧先兆， 樊友本

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科 甲狀腺甲狀旁腺中心，上海 200233）

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌腫瘤，約占全部腫瘤的3.8%[1]。2016年，美國(guó)約有2 000人死于甲狀腺癌[2]。其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，占全部甲狀腺癌的90%以上[3]。PTC發(fā)病率逐年增加，在我國(guó)列腫瘤發(fā)病率增長(zhǎng)第一位[4-5]。盡管PTC屬于相對(duì)惰性的分化型甲狀腺癌，絕大部分病情進(jìn)展緩慢，預(yù)后總體表現(xiàn)良好，但有部分表現(xiàn)為較高的侵襲性。腫瘤在很早期就可侵襲周?chē)M織，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至肺、骨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移灶不吸收碘并轉(zhuǎn)化為低分化或去分化的腫瘤[6-7]。因此，更好地理解PTC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移所涉及的機(jī)制很重要，且有指導(dǎo)臨床治療的重大意義。

外泌體近年來(lái)被認(rèn)為是細(xì)胞間交流的“信使”[8]。其通過(guò)活細(xì)胞多泡體與細(xì)胞膜融合，產(chǎn)生直徑20～200 nm的雙層膜囊泡[9]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的生物學(xué)作用[10-12]。本研究通過(guò)分離和鑒定KTC-1細(xì)胞的外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA作為腫瘤微環(huán)境的“信使”進(jìn)入KTC-1細(xì)胞。并證實(shí)，外泌體miRNA 146b-5p促進(jìn)KTC-1細(xì)胞體外遷移和侵襲，外泌體中的miRNA抑制劑可作為PTC的潛在治療方法。

材料和方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)和上清液收集

PTC細(xì)胞系KTC-1在RAPI-1640中培養(yǎng)，加入10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL鏈霉素。細(xì)胞在含有5%CO2的潮濕室，于37℃溫育并定期測(cè)試支原體 （R＆D Systems的新Myco-Probe Mycoplasma檢測(cè)試劑盒）。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%～70%密度時(shí)，用不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基替換。饑餓48 h后，收集細(xì)胞上清液并儲(chǔ)存于-80℃直至使用。

二、外泌體分離

根據(jù)有關(guān)分離細(xì)胞上清液外泌體研究描述的實(shí)驗(yàn)方法[13-14]：細(xì)胞上清在 2 000×g，4 ℃，離心 30 min。收集上清液繼續(xù)在10 000×g，4℃，離心30 min。最后得到上清液在110 000×g，4℃，離心70 min。將沉淀重懸于 2～3 mL 1×PBS 中，使用 0.22 μm 孔徑過(guò)濾器過(guò)濾。繼續(xù)在110 000×g，4℃，離心70 min。棄去上清液，50～100 μL，1×PBS 重懸備用。

三、外泌體鑒定

（1）透射電子顯微鏡（TEM）：將 20 μL 外泌體添加到銅網(wǎng)上，使其吸附1 min，用濾紙吸出過(guò)量液體。然后，用 2%（w/v）磷鎢酸（pH6.8）對(duì)吸附在銅網(wǎng)上的外泌體進(jìn)行負(fù)染色2 min，用濾紙吸除過(guò)量的液體。白熾燈下風(fēng)干，用TEM（飛利浦，日本）分析。

（2）納米流式細(xì)胞儀（nano FCM）分析：外泌體超速離心后重懸于 50～100 μL 1×PBS，取 10 μL 放入nano FCM（福流，廈門(mén)）進(jìn)行分析。

四、電轉(zhuǎn)miRNA進(jìn)入外泌體

用 100 μL LONZA 溶液 V（LONZA，德國(guó)）重懸。加入 20 μL Cy3-miRNA146b-5p或 miRNA146b-5p抑制劑（銳博，廣州）混合后置于電轉(zhuǎn)杯。用LONZA X-001程序電穿孔后立即置于冰上。電穿孔后的液體轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入4 mL 1×PBS和3 μL Dio（碧云天，南京），室溫下染色 30 min。 110 000×g，4℃，離心70 min后去除上清液。將沉淀懸浮于100 μL的1640培養(yǎng)基中，與15 000個(gè)KTC-1細(xì)胞共培養(yǎng)。保溫12 h后，固定細(xì)胞用DAPI染色（西格瑪，美國(guó)）。激光共聚焦顯微鏡（萊卡，德國(guó)）下觀察細(xì)胞形態(tài)。

五、體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

分別電轉(zhuǎn)miRNA146b-5p，miRNA146b-5p抑制劑以及miRNA146b-5p NC（銳博，廣州）進(jìn)入外泌體，分別與KTC-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組為miRNA146b-5p，miRNA146b-5p抑制劑，對(duì)照組為miRNA146b-5p NC。

（1）遷移實(shí)驗(yàn)：將 2×104個(gè)細(xì)胞，共 200 μL，重懸于無(wú)FBS的1640培養(yǎng)基中，置于每個(gè)小室的上層（BD，美國(guó)）。小室放于600 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃ 培養(yǎng)。24 h后收取小室，用含有0.1%的結(jié)晶紫固定5～10 min。水洗后棉簽擦干上室細(xì)胞，倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）下選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

（2）侵襲實(shí)驗(yàn)：每個(gè)小室上層涂有基質(zhì)膠（BD，美國(guó)）。 然后將 2×104個(gè)細(xì)胞，共 200 μL，重懸于無(wú)FBS的1640培養(yǎng)基中，放入小室上。小室放于600 μL含10%FBS的1640培養(yǎng)基中。在5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后收取小室。含有0.1%的結(jié)晶紫固定5～10 min，水洗后棉簽擦干上室細(xì)胞。倒置顯微鏡下選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。外泌體miRNA對(duì)KTC-1細(xì)胞遷移和侵襲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外泌體的分離和鑒定

收集KTC-1細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，依次離心收集外泌體。置于TEM下觀察，外泌體呈現(xiàn)球形或橢圓形囊泡（見(jiàn)圖1A）。nano FCM分析結(jié)果顯示，外泌體直徑≤200 nm（見(jiàn)圖1B）。以上結(jié)果表明，成功分離和鑒定KTC-1細(xì)胞分泌的外泌體。

二、外泌體miRNA146b-5p進(jìn)入KTC-1細(xì)胞

收集KTC-1細(xì)胞的外泌體，電轉(zhuǎn)Cy3-miRNA146b-5p進(jìn)入外泌體。用親脂膜染料Dio標(biāo)記外泌體。將外泌體Cy3-miRNA146b-5p與KTC-1細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，固定細(xì)胞，用DAPI染色。激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Dio標(biāo)記的外泌體和Cy3標(biāo)記的miRNA146b-5p進(jìn)入KTC-1細(xì)胞（見(jiàn)圖2）。

三、外泌體miRNA146b-5p促進(jìn)體外遷移和侵襲

收集KTC-1細(xì)胞的外泌體。將miRNA146b-5p與外泌體按照1∶1的比例，電轉(zhuǎn)miRNA146b-5p進(jìn)入外泌體，與KTC-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)表明外泌體miRNA146b-5p顯著促進(jìn)KTC-1細(xì)胞的體外遷移和侵襲（見(jiàn)圖3）。

四、外泌體miRNA146b-5p抑制劑抑制體外遷移和侵襲

將miRNA146b-5p抑制劑電轉(zhuǎn)入外泌體，并與KTC-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)表明，外泌體miRNA146b-5p抑制劑顯著抑制KTC-1細(xì)胞的體外遷移和侵襲（見(jiàn)圖4）。

圖1 外泌體的鑒定

圖2 miRNA146b-5p通過(guò)外泌體進(jìn)入KTC-1細(xì)胞

圖3 外泌體miRNA146b-5p促進(jìn)KTC-1細(xì)胞的體外遷移和侵襲

討 論

外泌體攜帶的miRNA對(duì)腫瘤的診治很有意義，因miRNA是由僅包含21～25個(gè)堿基對(duì)的非編碼RNA組成，并受到外泌體雙層膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)[15]。此外，與脂質(zhì)體和納米顆粒載體不同，外泌體含有跨膜和膜錨定蛋白，增強(qiáng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，從而促進(jìn)其內(nèi)部物質(zhì)的傳遞[16]。

通常miRNA通過(guò)抑制信使RNA（mRNA）的翻譯和影響其穩(wěn)定性，來(lái)影響細(xì)胞的生命周期，如調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。因此，miRNA失調(diào)在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的作用。

隨著miRNA研究的不斷深入，miRNA146b-5p被發(fā)現(xiàn)有癌基因的作用，可促進(jìn)胰腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等的侵襲和轉(zhuǎn)移[18-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA146b-5p也可促進(jìn)PTC的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。另外，miRNA146b-5p和let-7f可作為PTC的不良預(yù)后指標(biāo)[22]。在前期研究報(bào)道中，筆者發(fā)現(xiàn)，miRNA146b-5p通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面Wnt受體的抑制，直接靶標(biāo)鋅指因子3（ZNRF3）而促進(jìn)PTC細(xì)胞的遷移和侵襲。結(jié)果表明，miRNA146b-5p通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)PTC的侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并提出miRNA146b-5p作為PTC的潛在治療靶點(diǎn)[2 3]。由于miRNA療法尚處于起步階段，其抑制劑如何在體內(nèi)穩(wěn)定存在并持續(xù)發(fā)揮治療作用的問(wèn)題亟待解決。

外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間交流的“信使”。其是活細(xì)胞多囊泡與細(xì)胞膜融合產(chǎn)生的一類(lèi)直徑為20～200 nm雙層膜囊泡。外泌體廣泛來(lái)源于成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞，亦存在于各種體液如血漿、唾液、乳汁、腦脊液和尿液等中[8-11]。目前外泌體在甲狀腺癌中的研究尚處于起步階段。Lee等[24]通過(guò)甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1培養(yǎng)上清液，發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶miRNA146和miRNA222。Samsonov等[25]研究發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體miRNA21以及miRNA181a在甲狀腺濾泡性腫瘤和PTC病人中存在顯著性差異表達(dá)。有關(guān)PTC血漿外泌體miRNA表達(dá)譜分析以及特異性miRNA在PTC臨床診斷中的潛能等研究尚未見(jiàn)報(bào)道。其中，外泌體攜帶的miRNA因僅含21～25堿基，并受雙層膜結(jié)構(gòu)的包裹保護(hù)，在腫瘤分子診斷和治療中備受青睞[13]。

本研究在成功提取和鑒定外泌體的基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)KTC-1細(xì)胞分泌的外泌體可將miRNA146b-5p傳遞到KTC-1細(xì)胞中。外泌體miRNA146b-5p可促進(jìn)KTC-1細(xì)胞體外遷移和侵襲，且外泌體miRNA146b-5p抑制劑可抑制KTC-1細(xì)胞的體外增殖和侵襲。這些結(jié)果表明，外泌體miRNA146b-5p可能是治療PTC的生物學(xué)靶點(diǎn)。

圖4 外泌體miR146b-5p抑制劑可抑制KTC-1細(xì)胞的體外遷移和侵襲