龔靈茜

（湖南省長沙市雅禮中學，湖南 長沙 410004）

1 研究背景

筆者從湖南邵陽當?shù)氐哪毘戎鳟a(chǎn)區(qū)的腐爛臍橙、土壤中尋找產(chǎn)果膠酶的菌源。通過紫外誘變技術提高酶的產(chǎn)量，優(yōu)化誘變菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件，初步確定酶制劑脫囊衣工藝條件，為果膠酶大規(guī)模發(fā)酵提供參考依據(jù)，并且為生物酶法脫囊衣加工臍橙打下基礎。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離篩選

2.1.1 初篩各菌株的菌落形態(tài)特征。經(jīng)連續(xù)馴化富集實驗后，以富含果膠質(zhì)的臍橙囊衣果渣及柑橘果渣為唯一碳源及能源的培養(yǎng)基平板，對稀釋菌懸液進行培養(yǎng)，初篩結果及菌落形態(tài)特征描述見表1。

表1 初篩后各菌株的菌落形態(tài)

2.1.2 菌株復篩。將透明圈較大的P5、P6、P7、P8菌株，采用復篩培養(yǎng)基進行復篩，進行透明圈H(cm)、生長圈C(cm)值的測定和搖瓶產(chǎn)酶酶活力的定量檢測，測定結果見表2。

表2 復篩菌株H/C值與酶活力的比較

由表2復篩測定結果表明，菌株編號為P8酶活力較好；選擇該菌株進行分類鑒定。

2.1.3 菌株P8的分類鑒定。菌體形態(tài)特征。P8在PDA菌落初為白色，后其上密生一層黑色粉粒，似粗地毯狀。菌絲枝繁茂，幼時無隔，老齡有隔；小孢子囊常生在輪生孢囊梗的頂端，孢囊孢子大、色淡、單細胞。

分子生物學鑒定。真菌核糖體基因轉錄間隔區(qū)，又叫內(nèi)轉錄間隔區(qū)，主要包括內(nèi)轉錄間隔區(qū)1（ITS1）、5.8S rDNA、內(nèi)轉錄間隔區(qū)2（ITS2），其兩側分別是18S RNA基因和28S RNA基因。rDNA在種內(nèi)由于基因的流動而經(jīng)常表現(xiàn)出很高的同源性，在種間則保持著各種程度的變異。變異的多少能夠反映生物進化上屬內(nèi)種間親緣關系的遠近。將菌株P8的rRNAITS2基因序列與GenBank內(nèi)登錄的不同種屬霉菌的相應序列進行比對，分析各株序列間的同源性和差異及進化關系。通過上述菌落培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)觀察及18S RNA序列分析，初步鑒定P8為卷枝毛霉。

2.2 菌株P8的誘變及誘變株的篩選

2.2.1 紫外誘變時間。P8孢子紫外誘變劑量效應曲線如圖1所示?？梢钥闯觯琍8孢子經(jīng)紫外線照射后，再生菌落數(shù)逐漸減少。在0～10 min照射時間內(nèi)，曲線的變化很明顯。20 min以后，曲線的下降趨于平緩。根據(jù)圖1計算出P8最佳誘變的照射劑量為8 min。

圖1 紫外誘變劑量效應曲線

2.2.2 誘變菌株的初篩

以8 min作為照射劑量誘變P8孢子，分別誘變3批，每批誘變后的單孢子懸液梯度稀釋后涂10個平皿。待孢子在平皿上已再生出菌落后，用滅菌牙簽將菌落挑入初篩平板中，每個平板10株誘變菌株，培養(yǎng)2～3 d。為此，從300多株誘變菌株中總共選出40株生長速度快的誘變菌株。

2.2.3 誘變菌株的復篩

分別將40株誘變菌株每株接2個果膠酶篩選斜面培養(yǎng)，計算液體發(fā)酵產(chǎn)酶活力。根據(jù)酶活力的計算結果，從40株誘變菌株中選出酶活力較高的5株，進行下一步的研究。根據(jù)誘變時的原始批次和編號，這5株菌分別命名為Y-9、Y-14、Y-19、Y-26、Y-37。

2.2.4 高產(chǎn)誘變菌株

取上述5株誘變菌株連同原始菌株在接種量相同條件下，進行液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)實驗，平行實驗3次，產(chǎn)酶結果取平均值，結果見表3。根據(jù)表3的結果，選產(chǎn)酶活力明顯優(yōu)于原始菌株的Y-9、Y-26、Y-37編號的3株誘變菌株為高產(chǎn)誘變菌株。

表3 3株誘變菌株及原始菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶活力比較

表4 Y-9、Y-26和Y-37以及原始菌株P8連續(xù)進行10代發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)實驗

2.2.5 誘變菌株產(chǎn)酶的遺傳穩(wěn)定

鑒于誘變菌株的性狀常不穩(wěn)定，對得到的3株誘變菌株（Y-9、Y-26和Y-37）進行產(chǎn)酶的遺傳穩(wěn)定性實驗，結果見表4。

由表4可看出，Y-9和Y-37分別在傳代到第4代、第5代后，產(chǎn)量開始減少，遺傳不穩(wěn)定。Y-26在連續(xù)轉接的10代里菌株的產(chǎn)酶活力都很穩(wěn)定，并且都顯著超過了對照的原始菌株，其差異均達極顯著水平(p＜0.01)，顯示Y-26的遺傳性能穩(wěn)定，可用于后續(xù)實驗研究。

2.3 誘變菌株Y-26的液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件

2.3.1 不同碳源與誘變株Y-26的產(chǎn)酶活力。以常見的果膠含量較為豐富的果膠廢水、臍橙囊衣果渣、橙皮粉、柚皮粉、桔皮粉為材料。

添加純果膠及含果膠豐富的果膠廢水明顯促進誘變株Y-26聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶的合成，表明這兩種酶都屬于誘導酶。雖然純果膠作為碳源產(chǎn)酶活力高，但純果膠價格昂貴，造成生產(chǎn)成本高；橙皮粉、桔皮粉、臍橙囊衣果渣作為碳源產(chǎn)酶更經(jīng)濟，取材范圍廣，故用臍橙加工廢料作為Y-26的碳源來產(chǎn)酶，一方面可以節(jié)約成本，另外可避免因加工過程中囊衣及果皮丟棄造成環(huán)境污染。

2.3.2 不同氮源與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。本文以硫酸銨等為氮源探討了誘變株Y-26的產(chǎn)酶活力，結果見表5。

表5 不同氮源對誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

由表5可知，無機氮源硫酸銨產(chǎn)酶活力最高，平均達到35 172 U；尿素為氮源時酶活力次之；麥麩為氮源，菌株Y-26產(chǎn)酶力最低。因此，Y-26菌株以硫酸銨為氮源進行研究。

2.3.3 不同金屬離子與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。金屬離子能促進或抑制許多酶的產(chǎn)生，本文以Fe2+、Mg2+、Ca2+的不同濃度探討了誘變株Y-26的產(chǎn)酶活力。結果見表6。

表6結果表明，Mg2+對產(chǎn)酶影響最大，對產(chǎn)酶有一定的促進作用； Ca2+對產(chǎn)酶有一定的抑制作用； Fe2+對產(chǎn)酶基本無影響。

2.3.4 初始pH與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。在上述優(yōu)化的基礎上進行了不同起始pH對誘變株產(chǎn)酶活力的影響，結果見表7。

由表7可知，誘變株Y-26對pH的適應范圍較廣，培養(yǎng)基起始pH在3～8均可發(fā)酵產(chǎn)酶，當pH為5，誘變株Y-26產(chǎn)酶活力最高。

表6 不同金屬離子對誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

表7 初始pH對誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

2.3.5 培養(yǎng)時間與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。應用前面優(yōu)化出的最佳培養(yǎng)條件，考察培養(yǎng)時間對誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響。結果見表8。

表8 培養(yǎng)時間對誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

由表8知，在時間為96～120 h范圍內(nèi)酶活力較高，酶活力沒有顯著差異。考慮到產(chǎn)酶活力的穩(wěn)定性、節(jié)省時間及發(fā)酵所需的能源，最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時間有待進一步通過正交試驗優(yōu)化。

2.3.6 不同溫度與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力。誘變株Y-26置于不同溫度中，實驗不同溫度與誘變株Y-26產(chǎn)酶活力，結果見表9。

由表9知，在溫度為30℃～40℃范圍內(nèi)酶活力較高，考慮到節(jié)省能源，選擇30℃為最佳發(fā)酵產(chǎn)酶溫度。

表9 培養(yǎng)溫度對誘變株Y-26產(chǎn)酶活力的影響

2.4 誘變株Y-26酶制劑脫囊衣工藝初步研究

以酶制劑用量（酶濃度/%）、料液比（g/mL）、處理時間（min）、酸濃度（%）、溫度（℃）為實驗因素，以砂囊得率為酶解囊衣效果評價指標，采用正交實驗法對發(fā)酵酶制劑脫囊衣工藝進行優(yōu)化，實驗因素設計與水平見表10。

由表10可知，根據(jù)R值大小為E＞D＞B＞C＞A，即影響酶解臍橙囊衣得率的主次順序為溫度＞酸濃度＞料液比＞酶濃度＞時間；由表中K值分析可知酶解脫囊衣的最優(yōu)工藝組合為A4B1C3D4E4，即酶解時間為120 min，料液比為1:2，酶添加濃度為5%，酸濃度為0.5‰，酶解溫度為50 ℃。因此，需要以該工藝條件為驗證試驗，最后的砂囊得率為48.4%，故經(jīng)驗證實驗，A4B1C3D4E4為酶制劑脫囊衣的最佳工藝條件。

表10 正交實驗設計因素與水平表

3 結語

用傳統(tǒng)篩選和紫外誘變育種相結合技術手段，構建遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)酶活力高且對臍橙囊衣降解具有高度專一性的微生物——卷枝毛霉。初步確定臍橙脫囊衣專用產(chǎn)酶卷枝毛霉的發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)該酶制劑提供理論參考。用該工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，不添加任何防腐劑，延長產(chǎn)品保質(zhì)期，原有的酸堿脫囊衣技術將被徹底更新?lián)Q代。通過改善臍橙橙汁胞加工工藝，促進資源節(jié)約和環(huán)境保護，降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)品更具競爭力，產(chǎn)品質(zhì)量更安全可靠，有利于出口。